3.4. Перевод временных препаратов в постоянные

Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

Файл:

Методы микроскопического анализа в ботанике. Учебно-методическое пособие для студентов биологического факультета, обучающихся по направлению подготовк.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

07.09.2026

Размер:

1 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 34 / 64 5 6 > Следующая >>>

несколько продлить, если залить края покровного стекла парафином или бесцветным лаком.

Глицерин-желатиновые препараты имеют более длительный срок хранения: от нескольких месяцев до нескольких лет. На заключительном этапе приготовления таких препаратов объект заключают в каплю разогретого на водяной бане глицерин-желатина. Различные способы приготовления временных и глицерин-желатиновых препаратов лежат в основе ускоренных методов цитоэмбриологического анализа растений. Первоначально экспресс-методы использовали для подсчета числа хромосом, изучения процессов деления клетки и анализа развития мужской генеративной сферы растений. Позднее были разработаны ускоренные методы исследования женской генеративной сферы (Еналеева и др., 1972; Herr, 1971; Куприянов, 1978, 1989 и др.).

Наиболее длительный срок хранения имеют постоянные препараты, на которых объект заключен в канадский бальзам – смолу, получаемую из пихты бальзамической (Abies balsamea (L.) Mill.). Канадский бальзам, застывая, становится стеклоподобным, не мутнеет и не кристаллизуется. Его коэффициент преломления (1,55) близок к данному показателю оптического стекла типа кронов.

Временные препараты при необходимости могут быть переведены в постоянные по приведенной в следующем разделе методике.

Глицерин-желатин

1 г желатина заливают 6 мл дистиллированной воды. После того как желатин набухнет, добавляют 7 мл глицерина, размешивают и нагревают смесь па водяной бане до тех пор, пока желатин полностью не растворится. Готовую смесь хранят в холодильнике. Перед употреблением глицерин-желатин нагревают на водяной бане.

Канадский бальзам растворяют в ксилоле до консистенции жидкого мёда. Приготовленный раствор хранят в сосуде с плотно притерной крышкой при комнатной температуре. Если во время хранения вследствие испарения ксилола раствор канадского бальзама загустел, его необходимо развести ксилолом до нужной консистенции.

Канадский бальзам

3.4. Перевод временных препаратов в постоянные

На кусок сухого льда кладут стекло и закрывают полотенцем. После того как поверхность льда станет ровной, стекло убирают и помещают на лед препарат, располагая его покровным стеклом вверх. Все закрывают полотенцем и оставляют на 2–3 мин. При отсутствии сухого льда можно использовать морозильную камеру, на дно которой предварительно помещают небольшое стекло. Время пребывания препарата в морозильной камере увеличивают до 10–15 мин. После того как капля жидкости под покровным стеклом замерзнет, под угол покровного стекла аккуратно подводят лезвие бритвы и резким движением вверх снимают его. Данную процедуру следует проводить очень быстро, не давая капле растаять.

Необходимо также следить за тем, чтобы покровное стекло или лезвие бритвы не поцарапали препарат. Далее предметное и покровное стекло либо подсушивают при комнатной температуре в течение нескольких минут, либо последовательно выдерживают по 2–5 мин в 50, 70, 80, 96 и 100% (абсолютном) этиловом спирте (табл. 2) и в ксилоле. Затем на покровное стекло наносят каплю канадского бальзама и закрывают им препарат. Оставляют для подсушивания в термостате на несколько дней при температуре 50°С.

Таблица 2

Приготовление растворов этилового спирта разной концентрации

Концентрация спирта, %

90 93,5 6,5 80 83,3 16,7 70 72,9 27,1 60 62,5 37,5 50 52,1 47,9 40 41,6 58,4 30 31,2 68,8

Примечание. Расчет компонентов сделан для получения 100 мл готового раствора этилового спирта требуемой концентрации.

96% этиловый спирт дистиллированная вода

Компоненты раствора, мл

Абсолютный спирт получают из 96% спирта путем его обезвоживания. Для этого прокаленный белый медный купорос небольшими порциями заворачивают в фильтровальную бумагу. Полученные пакетики складывают в сосуд с притертой крышкой и заливают 96% спиртом из расчета 100 г обезвоженного медного купороса на 500 мл спирта. Банку закрывают притертой крышкой. Содержимое ежедневно взбалтывают в течение 4–5 суток, добиваясь посинения медного купороса. Абсолютный спирт хранят в емкости вместе с пакетами.

Для приготовления белого безводного купороса химически чистый синий купорос прокаливают в фарфоровой чашке. В результате прокаливания происходит удаление кристаллизационной воды из молекулы медного купороса. При прокаливании купороса необходимо соблюдать меры предосторожности. Прокаливание проводят небольшими порциями на малом огне через асбестовую сетку в фарфоровой чашке при постоянном помешивании фарфоровой или стеклянной лопаткой. Нельзя использовать металлические шпатели и проводить прокаливание в железной или никелированной посуде. Несоблюдение указанных правил может привести к пережиганию, точнее к разложению медного купороса с образованием окислов меди. Последнее обстоятельство весьма неблагоприятно сказывается на способности купороса поглощать воду из спирта. Обезвоженный медный купорос должен быть белым или слегка голубоватым. При перекаливании он приобретает серый цвет. Прокаленный купорос хранят в банке с притертой крышкой.

Абсолютный 100% этиловый спирт

При снятии покровного стекла возникает вероятность повреждения некоторых «хрупких» препаратов, поэтому в таких случаях можно использовать методику перевода временных препаратов в постоянные, которая не предполагает удаления покровного стекла. Растворы пропускают через

препарат посредством нанесения нескольких капель жидкости с одной стороны покровного стекла и отсасывания ее с помощью фильтровальной бумаги с другой его стороны. Последовательно используют следующие растворы: 45% уксусная кислота, смесь 96% спирта и ледяной (100%) уксусной кислоты в соотношении 1 : 2, 100% этиловый спирт. Подобным образом препарат последовательно можно также провести через растворы этилового спирта возрастающей концентрации (50, 70, 80, 96, 100%), ксилол и бальзам. Эта методика эффективна для препаратов, окрашенных ацетокармином.

4. МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ

ТОТАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ

ОСОБЕННОСТЕЙ ДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК, ПЛОИДНОСТИ

И КАРИОТИПА РАСТЕНИЙ

Изучение особенностей митотического деления клеток, плоидности и кариотипа растений проводят на препаратах апикальных корневых или стеблевых меристем. Чаще всего монослой делящихся клеток получают путем раздавливания кончика корешка или стебля. Для того чтобы растительные ткани стали более мягкими и лучше раздавливались, их мацерируют, обрабатывая кислотами (50%-ной НСl, 45%-ной уксусной кислотой и др.) или ферментами (цитазой, пектиназой), разрушающими межклеточное вещество.

4.1. Методика приготовления давленных препаратов клеток меристемы корня, окрашенных ацетокармином

Семена проращивают на влажной фильтровальной бумаге при температуре 22–24°С в чашках Петри или в медицинских лотках, плотно закрытых стеклом. После того как корешки достигнут размера 1,5–2 см, их обрезают и фиксируют в уксуснокислом спирте (3 : 1). При анализе плоидности растений рекомендуется перед фиксацией поместить срезанные корешки на 1 ч в 4% раствор гидрооксихинолина, который способствует большей компактизации хроматина.

8-гидрооксихинолин дистиллированная вода

Приготовление препарата включает следующие этапы:

1) несколько зафиксированных корешков помещают в тигель с водопроводной водой и оставляют на 15–20 мин или до тех пор, пока они не погрузятся на дно сосуда;

Гидрооксихинолин (4%)

43,5 мг 100 мл

2) в небольшой фарфоровый тигель или пенициллиновый пузырек наливают несколько миллилитров ацетокармина (объем красителя не должен превышать половины объема всего сосуда) и переносят туда корешки, предварительно слегка подсушив их на фильтровальной бумаге

3) корешки оставляют в красителе на 30 мин, затем тигель нагревают над пламенем спиртовки до интенсивного выделения паров. На данном этапе важно не доводить раствор до кипения и соблюдать меры предосторожности, поскольку горячий кармин при кипении может выплеснуться из сосуда. Процедуру нагревания корешков в кармине повторяют несколько раз (5–10), после чего остужают при комнатной температуре в течение 7–10 мин. В это время идет мацерация тканей корешка;

4) окрашенный корешок переносят на предметное стекло в каплю 45% уксусной кислоты. Осторожно лезвием бритвы отрезают кончик корешка (1–2 мм), остальную часть удаляют с предметного стекла препаровальной иглой или пинцетом. Каплю уксусной кислоты убирают фильтровальной бумагой и добавляют каплю дистиллированной воды;

5) закрывают покровным стеклом. Осторожно постукивая по покровному стеклу препаровальной иглой, раздавливают корешок до получения монослоя клеток. При приготовлении препарата с целью изучения плоидности растения и его кариотипа необходимо не только получить монослой клеток, но и «раздавить» клетки таким образом, чтобы хромосомы оказались лежащими в одной плоскости. Добиться этого можно, надавливая на покровное стекло тыльной стороной препаровальной иглы или пинцета, предварительно положив на предметное стекло сложенный вдвое лист фильтровальной бумаги.

4.2. Методика приготовления давленных препаратов клеток меристемы корня, окрашенных ацетогематоксилином

Данная методика используется для изучения кариотипа растений, как правило, в тех случаях, когда окраска кармином не дает желаемых результатов. Корешки из фиксатора помещают в небольшой тигель и затем меняют в нем раствор в следующей последовательности:

1) 1 N НСl (82 мл НСl + 918 мл дистиллированной воды) – 10 мин,

2) 50% НСl – 20 мин,

3) дистиллированная вода два раза по 3 мин,

4) уксусная кислота 45% – 20 мин,

5) ацетогематоксилин – от 1 ч и более (время окраски подбирается эмпирически для каждого объекта).

Окрашенный корешок переносят на предметное стекло в каплю смеси, состоящей из насыщенного раствора хлоралгидрата и 45% уксусной кислоты в соотношении 1 : 1. Лезвием отрезают кончик корня величиной 1–1,5 мм, удаляют оставшиеся части корешка. Закрывают покровным стеклом, постукивая по нему препаровальной иглой, раздавливают корешок до получения монослоя клеток.

4.3. Методика приготовления давленных препаратов клеток меристемы стебля, окрашенных ацетокармином

Приготовление препаратов корневой меристемы у некоторых растений осложняется тем, что корни плохо раздавливаются, а цитоплазма клеток перекрашивается. В таких случаях изучить митоз и кариотип растений можно на препаратах стеблевой меристемы. Для этого проросшие семена с ростком длиной около 1 см помещают в фиксатор Кларка (3 : 1) и выдерживают в нем не менее 12 ч. Зафиксированный материал хранят в 70% спирте со следами цитрата железа. Этапы приготовления давленного препарата стеблевой меристемы аналогичны этапам приготовления давленных препаратов корешков:

1) фиксированный материал переносят в тигель или небольшую термоустойчивую пробирку с ацетокармином (окрашивание можно проводить также в пенициллиновом пузырьке). Объем красителя не должен превышать 1/2 объема сосуда. Оставляют для окрашивания на 6–12 ч;

2) нагревают тигель в течение нескольких минут до интенсивного выделения паров над пламенем спиртовки;

3) переносят окрашенный росток на предметное стекло в каплю 45% уксусной кислоты. Лезвием отрезают конус нарастания. Препаровальной иглой или пинцетом убирают оставшиеся части. Закрывают конус нарастания покровным стеклом и, осторожно надавливая на него препаровальной иглой, раздавливают до получения монослоя клеток.

5. УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА МУЖСКОЙ ГЕНЕРАТИВНОЙ СФЕРЫ РАСТЕНИЙ

Изучение особенностей мужских генеративных структур способствует решению ряда теоретических и прикладных научных задач. Например, данные о развитии и строении мужского гаметофита необходимы для уточнения систематического положения и определения способа репродукции растения, установления причин снижения семенной продуктивности, выявления механизмов адаптации растений к внешним факторам, биоиндикации состояния окружающей среды и др.

5.1. Методика приготовления давленных препаратов пыльников, окрашенных ацетокармином

Давленные препараты пыльников применяют для изучения микроспорогенеза и особенностей мейоза у растений. Простота приготовления препарата позволяет использовать данную методику даже в полевых условиях.

1. Цветки из фиксатора переносят на предметное стекло в каплю дистиллированной воды. Препаровальными иглами выделяют из цветков пыльники. Удаляют части цветка и воду фильтровальной бумагой. Добавляют каплю ацетокармина. При необходимости (например, в полевых условиях) этап фиксации материала можно исключить и выделенные из живых цветков пыльники непосредственно поместить в каплю ацетокармина.

2. Закрывают пыльники покровным стеклом. Постукивая по стеклу препаровальной иглой, осторожно раздавливают пыльники так, чтобы пыльца вышла из них. Препарат имеет очень короткий срок хранения (не более 1 ч). Препарат анализируют сразу после его приготовления с помощью светового микроскопа.

5.2. Методика приготовления давленных препаратов пыльников, окрашенных ацетогематоксилином

Приготовление давленных препаратов пыльников, окрашенных ацетогематоксилином, как и вышеописанную методику, используют для изучения процессов микроспорогенеза и микрогаметофитогенеза. Если у изучаемого объекта цветки и пыльники имеют небольшие размеры (несколько миллиметров), то первые два этапа приготовления препарата проводят с целыми цветками. Если же пыльники крупные, то перед тем, как приступить к приготовлению препарата по данной методике, их выделяют из цветка.

1. Зафиксированные цветки или целые пыльники (в зависимости от размера объекта) помещают в небольшой сосуд (тигель или пенициллиновый пузырек) с 1N НСl (82 мл НС1 + 918 мл дистиллированной воды) на 10 мин, а затем на 20 мин в 50% раствор НСl.

2. Отмывают от кислоты два раза по 3 мин в дистиллированной воде и помещают в ацетогематоксилин на 1–2 ч.

3. На предметное стекло капают смесь из равных частей насыщенного раствора хлоралгидрата и 45% уксусной кислоты и переносят в неё цветки.

4. Препаровальными иглами выделяют из окрашенных цветков пыльники, отводят их в сторону, а каплю с оставшимися частями цветка удаляют со стекла фильтровальной бумагой.

5. Добавляют каплю насыщенного раствора хлоралгидрата и уксусной кислоты (1 : 1). Препаровальными иглами выделяют из пыльников пыльцу. Пинцетом или иглами удаляют части пыльника. Накрывают каплю с пыльцой покровным стеклом.

Препарат анализируют непосредственно после приготовления с помощью светового микроскопа. Для более длительного хранения препарата можно залить все стороны покровного стекла расплавленным парафином (клеем БФ, бесцветным лаком) или перевести его в постоянные.

5.3. Методика приготовления временных ацетокарминовых препаратов зрелой пыльцы

Методика используется для изучения микрогаметофитогенеза и структуры зрелых пыльцевых зерен. В зависимости от размера цветков и специфики цветения изучаемого объекта все нижеописанные процедуры проводят либо с целыми пыльниками (пшеница, рожь и др.), либо с собранной пыльцой (кукуруза, сорго и др.). При работе с целыми пыльниками их переносят из одного раствора в другой с помощью пинцета. Если препарат приготавливают непосредственно из зафиксированной пыльцы, ее помещают в небольшой сосуд (пенициллиновый пузырек, пробирку или тигель). Наливают в него достаточное количество раствора (не более 1/2 объема сосуда), оставляют на указанное в методике время и затем аккуратно сливают раствор так, чтобы пыльца оставалась на дне сосуда.

1. Пыльцу, зафиксированную в фиксаторе Кларка (3 : 1), отмывают от фиксатора, последовательно помещая ее сначала в растворы этилового спирта с возрастающей концентрацией (70, 80 и 96%), а затем в дистиллированную воду (способы приготовления спиртов приведены в параграфе 3.4).

2. Перед окрашиванием проводят протравливание материала. Для этого пыльцу выдерживают в течение 20 мин в 4% растворе железоаммонийных квасцов.

3. Промывают пыльцу дистиллированной водой и помещают её в ацетокармин на несколько часов. Оптимальное время окрашивания подбирают эмпирически для каждого объекта. Для наилучшего окрашивания ядерных структур можно оставлять пыльцу в ацетокармине при комнатной температуре на несколько суток. В данном случае получают регрессивную (перекрашенную) окраску.

4. Пыльцу несколько раз промывают дистиллированной водой. Для этого меняют воду в сосуде до тех пор, пока она перестанет окрашиваться. Окрашенную пыльцу можно в течение длительного времени хранить в 96% этиловом спирте или сразу приступить к следующему этапу приготовления препарата.

5. Пыльцу помещают на предметное стекло в каплю 45% уксусной кислоты. Накрывают покровным стеклом и подогревают над пламенем спиртовки. Не следует допускать закипания раствора под покровным стеклом. Во время нагревания происходит обесцвечивание препарата. Периодически контролируют степень просветления цитоплазмы пыльцевых зерен с помощью светового микроскопа. При нагревании уксусная кислота испаряется, поэтому по мере необходимости ее добавляют. Для этого препаровальной иглой слегка поднимают покровное стекло и наносят каплю уксусной кислоты.

6. После достижения оптимальной степени окрашивания препарата покровное стекло снимают, подняв его с одной стороны препаровальной иглой или лезвием. Удаляют уксусную кислоту фильтровальной бумагой и добавляют каплю глицерина. Тщательно перемешивают препаровальной иглой. Для того чтобы не повредить пыльцу, иглу следует держать вертикально и не отрывать ее от поверхности предметного стекла. Каплю с пыльцой накрывают чистым покровным стеклом и анализируют с помощью светового микроскопа.

5.4. Методика приготовления глицерин-желатиновых

препаратов зрелой пыльцы, окрашенной ацетокармином

Методика используется для изучения особенностей структуры зрелых

пыльцевых зерен, а также для определения качества пыльцы.

1. Фиксированный цветок переносят на предметное стекло в каплю дистиллированной воды. С помощью препаровальных игл из него выделяют пыльники. Удаляют лишние части цветка фильтровальной бумагой или пинцетом.

2. Препаровальными иглами выделяют пыльцу из пыльников. Удаляют оставшиеся части пыльника иглой или пинцетом.

3. Добавляют каплю ацетокармина. Все перемешивают, при этом препаровальную иглу держат вертикально, не отрывая ее от поверхности предметного стекла.

4. Добавляют каплю разогретого на водяной бане глицерин-желатина, и круговыми движениями иглы еще раз все тщательно перемешивают. Закрывают покровным стеклом.

Анализ структуры пыльцевых зерен осуществляют с помощью свето-

вого микроскопа после того, как застынет глицерин-желатин.

5.5. Анализ качества пыльцы

Для оценки качества пыльцы используют показатель степень дефект-

ности пыльцы (СДП). Степень дефектности пыльцы растения есть доля

дефектной пыльцы в процентах от общего количества проанализированных пыльцевых зерен (ПЗ):

СДП

Количество дефектных ПЗ

Количество проанализированных ПЗ

× 100%.

Средняя СДП растений популяции вычисляется как средняя арифметическая от СДП отдельных экземпляров. При определении СДП производят подсчет дефектных и нормальных пыльцевых зерен в нескольких полях зрения. Обязателен охват полей зрения в верхней, средней и нижней частях стекла. На каждом препарате подсчитывают не менее 100 пыльцевых зерен. По степени дефектности пыльцу делят на три группы:

А – выполненные, хорошо окрашенные пыльцевые зерна;

В – пыльцевые зерна с признаками плазмолиза цитоплазмы;

С – пустые (дегенерирующие) пыльцевые зерна.

По размеру пыльцевые зерна также делят на 3 группы:

1 – крупные (их размеры в несколько раз превышают размер большинства пыльцевых зерен);

2 – средние (размер основной массы исследуемой пыльцы);

3 – мелкие (их размеры в несколько раз меньше размера большинства пыльцевых зерен).

Пыльцевые зерна группы А2 являются нормальными, а пыльца всех остальных групп – дефектной (рис. 6). Данные о пыльце заносят в таблицу (табл. 3).

Рис. 6. Пыльцевые зерна Poa macrocalyx

Таблица 3

Качество пыльцы растений исследуемой популяции

№ рас-

тения

Примечание. А1 – выполненная пыльца крупного размера; А3 – мелкая выполненная пыльца; В1 – плазмолизированная пыльца крупного размера; B2 – плазмолизированная пыльца среднего размера и т. д.

Количество исследован-

ных ПЗ, шт.

Нормальные

(А2) ПЗ, %

Дефектные ПЗ, % СДП,

А1 А3 В1 В2 и т. д.

5.6. Методы изучения роста пыльцевых трубок в тканях пестика

Далеко не у всех видов растений удается стимулировать процесс прорастания пыльцевых трубок в условиях in vitro. Часто с такими трудностями исследователи сталкиваются при работе с растениями, зрелая пыльца которых имеет трехклеточное строение, как, например, у злаков. В таких случаях процессы роста пыльцевых трубок можно изучить непосредственно в тканях пестика. Кроме того, в селекционно-генетических работах по созданию отдаленных гибридов и при изучении явлений самонесовместимости растений также зачастую возникает необходимость исследовать процессы прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок на рыльцах и в столбиках. Приготовление препаратов для анализа роста пыльцевых трубок в тканях пестика можно проводить по нижеприведенной методике.

1. Из свежесобранного пыльника с помощью препаровальных игл выделяют пыльцу и наносят ее на рыльца предварительно кастрированных и изолированных цветков. Закрывают цветки изоляторами и через некоторое время (от 30 мин и более) проводят однократную или темпоральную фиксацию опыленных цветков.

2. Фиксированные цветки помещают на предметное стекло и с помощью препаровальных игл отделяют от них пестики или только столбики. Помещают их на несколько минут в дистиллированную воду для промывки.

3. Переносят пестики в пенициллиновый пузырек с 1N NаОН (12 г NаОН и 300 мл дистиллированной воды). Оставляют на несколько часов. Время обработки подбирается эмпирически для каждого объекта. Например, для томатов достаточно 1 ч, пестики косточковых необходимо выдерживать в растворе щелочи не менее 2–3 суток. Сократить время обработки можно, прокипятив объект в растворе NаОН в течение 10 мин.

4. Сливают щелочь и наливают в пузырек водопроводную воду. Закрывают отверстие пузырька кусочком марли и плотно обвязывают горлышко сосуда нитью. Пузырек опускают в стакан с водой, затем помещают под небольшую струю проточной воды. Оставляют для промывки на 1 ч.

<<< < Предыдущая 1 2 34 / 64 5 6 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]