танике люминесцентную микроскопию используют для изучения живых клеток, химического состава клеток и тканей, кариотипов и хромосом рас­тений.

тического микроскопа, который позволяет получать максимально возмож­ное, для световых микроскопов, разрешение благодаря применению лазера в качестве источника освещения и особому способу получения изображе­ния. За счёт ограничения глубины фокуса и использования точечных коге­рентных источников света в этом типе микроскопов происходит послойное формирование изображения объекта на одном уровне глубины резкости. Это позволяет проводить оптическое секционирование образца по глубине, т. е. получать серию изображений на разных глубинах фокальной плос­кости, а затем на их основе реконструировать трехмерное изображение ис­следуемого объекта. Это применимо для визуализации как фиксированных, так и живых клеток и тканей.

Конфокальная микроскопия имеет ряд преимуществ по сравнению с обычной оптической микроскопией: 1) возможность контроля глубины резкости; 2) устранение или уменьшение шумов вне фокуса (фон приводит к ухудшению качества изображения); 3) возможность сбора последователь­ных оптических срезов из толстых образцов. Разрешение конфокальных микроскопов превышает разрешение оптических широкопольных микро­скопов, но значительно меньше разрешения просвечивающих электронных микроскопов. Вследствие чего конфокальную микроскопию считают своего рода мостом между этими двумя типами микроскопии.

однородностью состава, особенностями рельефа поверхности и др.). Такие микроскопы используют для изучения микроморфологии и тонкой струк­туры поверхности образцов.

Микроскоп состоит из четырёх частей: механической, оптической (осветительной), воспроизводящей и визуализирующей (рис. 3). К ме- ханической части относится штатив (основание), предметный столик, коробка механизмов с макро- и микрометрическими винтами. Штатив представляет собой блок, на котором крепится весь микроскоп. В простых микроскопах на основание устанавливают осветительные зеркала или накладные осветители. Предметный столик служит для размещения на нем предметного стекла с микропрепаратами. Он может перемещаться в горизонтальной плоскости, что позволяет менять участки препарата, попадающие в поле зрения. Макро- и микровинты поднимают и опускают тубус или предметный столик (в зависимости от конструкции микроскопа), обеспечивая настройку резкости изображения. Макровинт используется при работе на малом увеличении, а микровинт – на большом.

1. Настраивают осветитель­ную систему микроскопа по прин­ципу Келлера (см. раздел 1.4.1) для работы методом светлого по­ля.

2. С помощью сухого объек­тива (×10, а затем×40 или×60) настраивают четкое изображение анализируемого объекта.

5. Вводят в ход лучей иммер­сионный объектив (50×МИ или 100×МИ) и опускают его до со­прикосновения с каплей иммерси­онной жидкости, затем, наблюдая в микроскоп, с помощью макро­и микровинтов настраивают рез­кость изображения.

7. Процесс очистки прово­дят следующим образом. Объек­тив вывинчивают из микроскопа или устанавливают в положение, удобное для чистки. Сухим ват­ным тампоном одним движением руки снимают иммерсионное мас­ло с фронтальной линзы. Тампо­ном, смоченным спирт-эфирной смесью (или 70% спиртом), без

18

лучению четкого изображения внутриклеточного содержимого. Устранить этот недостаток можно, используя в качестве среды растворы с показате­лем преломления близким к коэффициенту преломления кутикулы (1,47– 1,52). Такими показателями характеризуются силиконовые масла (1,47– 1,53), в том числе вазелиновое масло (1,48) (для сравнения коэффициент преломления воды – 1,33). Масла не токсичны для растительных клеток. Заполняя неровности поверхности кутикулы, они делают ее оптически го­могенной и прозрачной.

Содержащийся в большом количестве в межклеточниках растительных тканей воздух нередко негативно влияет на качество препарата и затрудня­ет его изучение. Сделать объект более прозрачным можно, заменив воздух в межклеточниках водой с использованием вакуумного насоса или путем инфильтрации тканей по В. Я. Александрову (1954).

Из медицинского шприца вынимают поршень. Закрывают пальцем от­верстие наконечника. В шприц заливают водопроводную воду и помещают в нее кусочек ткани или органа растения. Вставляют поршень, перево­рачивают шприц наконечником вверх и выдвигают поршень до тех пор, пока не выйдет весь воздух. Закрывают пальцем отверстие наконечника, поршень с усилием оттягивают назад. Таким образом над жидкостью со­здается вакуум. При этом из объекта выделяются пузырьки воздуха. От­пускают поршень, вакуум исчезает, и межклеточники заполняются водой. Повторяют всю процедуру 2-3 раза. Кусочки растительных тканей и орга­нов после инфильтрации можно анализировать непосредственно в капле водопроводной или речной воды, накрыв их покровным стеклом. Также можно поместить объект в каплю силиконового масла, предварительно уда­лив с его поверхности излишнюю влагу фильтровальной бумагой. Препарат анализируют с помощью светового или фазово-контрастного микроскопа.

2) на чистое предметное стекло наносят каплю водопроводной или прудовой воды. Помещают в нее лист или его часть;