Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методы микроскопического анализа в ботанике. Учебно-методическое пособие для студентов биологического факультета, обучающихся по направлению подготовк.pdf
5. Сливают водопроводную воду и наливают в пузырек с пестиками
дистиллированную воду на 10–15 мин.
6. Сливают воду и заливают краситель на 1 сутки. Для окрашивания
пестиков используют смесь 1% раствора анилинового синего и 1% раствора трехзамещенного фосфата калия (K3PO4)
7. На предметное стекло наносят каплю красителя и переносят в нее
пестики. При необходимости пестики или завязи можно разрезать вдоль.
Накрывают покровным стеклом и осторожно раздавливают пестик, постукивая препаровальной иглой по покровному стеклу.
Анализ препарата проводят с помощью флуоресцентного микроскопа. Пыльцевые трубки в тканях пестика светятся ярко-желтым цветом
с золотистым оттенком. Свечение обусловлено образованием комплексов
красителя с полисахаридной каллозой, которая входит в состав оболочек
пыльцы и пыльцевых трубок.
в соотношении 3 : 1.
6. УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЖЕНСКОЙ ГЕНЕРАТИВНОЙ СФЕРЫ РАСТЕНИЙ
Ускоренные методы приготовления препаратов завязей, семязачатков
и зародышевых мешков растений отличаются от классических методов
приготовления микротомных срезов, прежде всего тем, что позволяют
анализировать большой объем растительного материала в относительно
короткие сроки. Разработка ускоренных методов позволила перевести эмбриологические исследования на популяционный уровень и изучить явления, встречающиеся с низкой частотой.
6.1. Методика выделения целых зародышевых мешков
с помощью ферментативной мацерации и последующей
диссекции семязачатков
Методика применяется для анализа структуры женского гаметофита
у растений, в завязи которых развивается один крассинуцелятный
семязачаток (Куприянов, 1978). Метод позволяет изучать структуру
сформированных и зрелых зародышевых мешков, а также ранние стадии
эмбрио- и эндоспермогенеза. Его ключевым этапом является обработка
завязей растворами ферментов, разрушающих компоненты клеточных
стенок (в первую очередь пектина). В результате мацерации клетки
легко отделяются друг от друга, что позволяет с помощью микроигл
выделить из семязачатка зародышевый мешок. В качестве мацерирующего
агента можно использовать цитазу (смесь ферментов желудочного сока
41
виноградной улитки), аптечные препараты (Мезим форте или Панзинорм
форте), а также концентрированные растворы соляной кислоты.
Приготовление раствора цитазы
Виноградных улиток помещают в стеклянную банку, плотно закрывают марлей
или полиэтиленовой крышкой, в которой сделано несколько отверстий. Оставляют
улиток без корма в течение 2–3 суток. После этого улиток моют и препарируют. Раковину улиток разбивают, пинцетом подхватывают пищеварительную железу
и сцеживают ее содержимое в стеклянный сосуд. Собранный пищеварительный сок
фильтруют, переливают в пластиковые плотно закрывающиеся пузырьки и хранят
в морозильной камере. Замороженный раствор не теряет ферментативной активности в течение нескольких лет. Перед использованием раствор цитазы размораживают.
Приготовление мацерата из аптечных препаратов
Растворяют одну таблетку аптечного препарата Мезим форте или Панзинорм
форте в 10 мл дистиллированной воды комнатной температуры. Образовавшуюся
взвесь фильтруют. Полученный прозрачный раствор светло-желтого цвета хранят
в холодильнике. Он сохраняет ферментативную активность в течение довольно
длительного времени.
Этапы приготовления препарата зародышевого мешка показаны на
рис. 7.
1. Фиксированные цветки или соцветия промывают проточной водой
в течение 1 суток. Объект помещают в марлевый мешочек, который завязывают и опускают в стакан с водопроводной водой. В стакан опускают
воронку и ставят его под струю холодной воды. Оставляют не менее чем
на 24 ч.
2. Цветки или соцветия переносят в небольшой сосуд (пенициллиновый пузырек, пробирку и т. п.) с ацетокармином. Краситель должен
полностью закрывать объект. Оптимальное время окрашивания подбирают эмпирически для каждого вида растения. При комнатной температуре
оно может составлять от нескольких часов до 1–2 суток. Интенсивность
окраски увеличивается, если перед окрашиванием материал поместить
на нескольких часов в 4% раствор железоаммонийных квасцов, а процедуру окрашивания проводить в термостате при температуре 50°С.
3. Окрашенный материал помещают в марлевый мешочек и промывают в течение 1 суток водопроводной водой. После этого материал можно
в течение нескольких дней хранить в холодильнике в сосуде с дистиллированной водой или сразу приступить к следующему этапу приготовления
препарата.
4. Окрашенный цветок переносят пинцетом на предметное стекло
в каплю дистиллированной воды. С использованием стереомикроскопа
(МБС-9 и т. п.) из цветков препаровальными иглами выделяют завязи.
Микропипеткой или иглой осторожно переносят завязи на стекло с лункой
в раствор цитазы. Стекло помещают в чашку Петри, на дно которой кла-
42
Рис. 7. Выделение целых зародышевых мешков с помощью ферментативной мацерации и последующей диссекции семязачатков: а – выделение завязей из цветков; б –
мацерация завязей в растворе цитазы; в – электролитически заточенные микроиглы;
г – размацерированная окрашенная завязь мятлика лугового; д – выделение зародышевого мешка из семязачатка (сем) с помощью микроиглы (ми); е – очищение
зародышевого мешка (ЗМ) от клеток нуцеллуса семязачатка; ж – выделенный
зародышевый мешок
43
дут фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой. Чашку
Петри закрывают и оставляют при комнатной температуре на 1 сутки.
5. Пипеткой осторожно удаляют цитазу, так чтобы завязи остались
на дне лунки. Промывают завязи, 2-3 раза меняя в лунке дистиллированную воду. Капают в лунку глицерин. Окрашенные и размацерированные
завязи могут храниться в капле глицерина в течение нескольких дней. При
этом необходимо следить за тем, чтобы фильтровальная бумага в чашке
Петри оставалась влажной.
6. Микропипеткой или препаровальной иглой переносят 1-2 завязи
на предметное стекло в каплю глицерина. С помощью микроигл
из завязи выделяют семязачаток, а затем из семязачатка зародышевый
мешок.
7. На это же предметное стекло рядом с каплей, в которой выделяли
зародышевый мешок, наносят еще одну каплю глицерина. Препаровальной иглой делают между двумя каплями узкую глицериновую дорожку.
По этой дорожке с помощью микроиглы переводят в чистую каплю выделенный зародышевый мешок. Каплю с оставшимися частями завязи осторожно стирают со стекла фильтровальной бумагой.
8. В каплю с зародышевым мешком капают разогретый на водяной
бане глицерин-желатин и тщательно перемешивают. Осторожно микроиглой опускают зародышевый мешок на дно капли и закрывают покровным
стеклом.
9. После того как глицерин-желатин застынет, место, где лежит зародышевый мешок, обводят тушью или маркером.
Препарат анализируют с помощью светового микроскопа.
6.2. Методика выделения целых
зародышевых мешков
из мацерированных соляной кислотой семязачатков
В данном варианте методики мацерация проводится растворами соляной кислоты, а окрашивание – двумя красителями: реактивом Шиффа
и кармином (Орлова, Авалкина, 1985).
1. Фиксированные цветки или соцветия промывают дистиллированной водой в течение 17–18 ч. Цветки помещают в просторный сосуд
и меняют в нем несколько раз дистиллированную воду.
2. Проводят холодный гидролиз. Помещают цветки сначала на 1,5 ч
в сосуд с 1N НСl (82 мл НСl и 918 мл дистиллированной воды), затем
на 2 ч в раствор 5N НСl (205 мл НСl и 295 мл дистиллированной воды),
и снова в 1N НСl на 1 ч.
3. Помещают цветки в реактив Шиффа и оставляют в холодильнике
при температуре 2–4°С на 17–18 ч.
44
4. Окрашенные цветки промывают сначала три раза по 30 мин серни-
стой водой, а затем 3–4 часа водопроводной водой.
5. Пинцетом переносят цветок на предметное стекло в каплю глицерина. С помощью препаровальных игл вычленяют из цветка завязь. Удаляют
остатки цветка. Микроиглами выделяют из завязи семязачаток, а затем
из семязачатка зародышевый мешок.
6. Подкрашивают выделенный зародышевый мешок кармином. После
этого наносят каплю раствора Гойера и закрывают покровным стеклом.
10 мл дистиллированной воды нагревают, не доводя до кипения. В горячей
воде растворяют 6 г химически чистого гуммиарабика, 3,2 г глицерина и 40 г хлоралгидрата. Раствор можно использовать сразу после приготовления.
Раствора Гойера
6.3. Методика выделения целых зародышевых мешков
с помощью ферментативной мацерации семязачатков
и последующего центрифугирования
Данный метод (Еналеева и др., 1972) используют для изучения структуры женских гаметофитов растений, в завязях которых развивается большое
количество сравнительно мелких семязачатков (табак, перец и др.) (рис. 8).
1. Цветки промывают от фиксатора в течение 1 суток в проточной воде.
На предметном стекле в капле дистиллированной воды с помощью препаровальных игл выделяют из цветков завязи, а затем из завязей – семязачатки.
2. Переносят семязачатками в пробирки Эппендорфа с раствором цитазы.
Помещают пробирки в качалку и оставляют на 1 сут для того, чтобы прошла
мацерация тканей и образовалась клеточная суспензия.
3. Далее все операции производят по следующей схеме: пробирку с суспензией клеток центрифугируют (10–20 оборотов в мин) в течение нескольких минут с целью осаждения клеток на дно, пипеткой удаляют жидкую
фракцию, капают в пробирку другой раствор, закрывают ее и несколько
раз встряхивают. Повторяют всю процедуру сначала. Растворы в пробирке
меняют в следующей последовательности:
1) дистиллированная вода – 1 мин;
2) 4% железоаммонийные квасцы – 1–2 мин;
3) дистиллированная вода – 1 мин;
4) ацетокармин – 20 мин;
5) дистиллированная вода – 1 мин;
6) глицерин.
В пробирке с глицерином суспензию клеток можно хранить в течение
нескольких дней и даже месяцев. Перед анализом пробирку с суспензией
хорошо встряхивают, наносят каплю суспензии па предметное стекло и накрывают покровным стеклом.
45
Рис. 8. Выделение целых зародышевых мешков табака (Nicotianum tabacum) с помощью
ферментативной мацерации семязачатков и последующего центрифугирования: а – плацента
с семязачатками, выделенная из зафиксированной завязи с помощью препаровальных игл;
б – отделение препаровальными иглами семязачатков от плаценты; в –перенос выделенных
семязачатков в пробирку с цитазой; г – пробирки с цитазой, в которую перенесены выделенные из завязей семязачатки; д – шейкер с пробирками, в которых происходит мацерация
семязачатков; е – центрифугирование пробирок с целью осаждение клеток на дно; ж –
замена раствора в пробирке; з – клеточная суспензия с зародышевыми мешками; и –
зародышевый мешок
6.4. Методика приготовления препаратов семязачатков посредством просветления тканей
Просветление семязачатков (Herr, 1971) применяют для изучения процессов мегаспорогенеза, эмбрио- и эндоспермогенеза. В основе метода лежит использование реактивов, которые обезвоживают объект и делают его
46
прозрачным. В настоящее время разработаны разные по составу просветляющие смеси (Семенова, 1988), но наиболее часто используют жидкость
Герра (смесь 41/2). Ниже приводятся три варианта просветления семязачатков: оригинальная методика, разработанная Jm. J. M. Herr (1971), и две
ее модификации (Юдакова, 1999).
1
1
Просветляющая жидкость Герра (смесь 41/
гвоздичное масло
хлоралгидрат
фенол
молочная кислота (80%)
ксилол
Все компоненты последовательно соединяют друг с другом. Периодически перемешивают до полного растворения сухих веществ. Хранят во флаконе с притертой
крышкой в темном месте.
1
1
/
KJ – 41/
/2(Йодистый калий – 41/
2
2
К 9 г жидкости Герра добавляют 100 мг йода и 600 мг йодного калия. Эта модифицированная жидкость хорошо выделяет структурные особенности объекта, а также
позволяет обнаружить место аккумуляции крахмала.
1
1
/
BB – 41/
/2(Бензилбензоат – 41/
2
2
К жидкости Герра добавляют 1 весовую часть бензилбензоата. Таким образом,
соотношение весовых частей в данной модификации жидкости Герра будет составлять
2 : 2 : 2 : 2 : 1 : 1. Обработку материала в данной смеси проводят в течение не менее
чем 14 суток.
1
1
KMnO4– 41/
/
/2(Перманганат калия – 41/
2
2
К 1 г жидкости Герра добавляют 3 мг перманганата калия. Так как раствор
неустойчив, его необходимо готовить непосредственно перед применением. Появление
осадка указывает на снижение просветляющего действия жидкости.
/
/2)
2
2
2 весовых части
2 весовых части
2 весовых части
2 весовых части
1 весовая часть
1
1
/
/2)
2
2
1
1
/
/2)
2
2
1
1
/
/2)
2
2
Вариант 1
1. Цветки или отдельные завязи помещают на 24 ч в фиксатор Навашина или смесь, состоящую из формалина, пропионовой кислоты и 50%
этилового спирта (5 : 5 : 90). После фиксации для дальнейшего хранения материал переносят в 70% этиловый спирт.
2. Завязи помещают в небольшие стеклянные пробирки с просветляющей
жидкостью и оставляют на 24 ч.
3. На предметном стекле в капле жидкости Герра с помощью препаровальных игл выделяют из просветленных завязей семязачатки и помещают
их в пробирку с абсолютным спиртом. Оставляют на 1 сутки.
4. Последовательно переносят семязачатки в пробирки со смесью этилового спирта и ксилола в следующих соотношениях: 3 : 1; 2 : 2 и 1 : 2. В каждой смеси выдерживают материал не менее 1 ч.
5. Переносят семязачатки в специальные микрокамеры, которые готовят
путем приклеивания с помощью канадского бальзама к предметному стеклу
47
двух покровных стекол на расстоянии 1 см друг от друга. Смонтированное таким образом предметное стекло помещают в термостат при 50°С,
оставляют на три дня для затвердения бальзама. Наносят каплю просветляющей жидкости между приклеенными покровными стеклами, переносят
в нее семязачатки, накрывают третьим покровным стеклом. Оставляют для
просветления не менее чем на 1 сутки.
Анализ препаратов проводят с помощью фазово-контрастного микро-
скопа.
Вариант 2
В отличие от вышеописанной оригинальной методики Jm. J. M. Herr
(1971), в этом варианте предобработку материала с целью его обезвоживания
проводят не этиловым спиртом, а глицерином (Юдакова, 1999). Кроме того,
для получения более контрастного изображения одновременно с обезвоживанием объекта можно провести его подкраску, поместив материал в смесь
глицерина и ацетокармина в соотношении 5 : 1 (рис. 9).
1. Зафиксированные в фиксаторе Кларка (3 : 1) цветки или целые соцветия (в зависимости от размера объекта) промывают проточной водой
в течение 1 суток. Для удаления воздуха из межклеточного пространства
можно провести предварительную инфильтрацию тканей по В. Я. Александрову (см. пункт 2.1.2).
2. Переносят цветки на предметное стекло в каплю дистиллированной
воды. Препаровальными иглами выделяют из цветков завязи. Можно также
частично снять и покровы завязи, если это позволяют сделать особенности
их строения и размеры.
3. Помещают выделенные завязи в пробирку Эппендорфа с 0,5 или 1 мл
глицерина или смесью глицерина и ацетокармина (5 : 1). Оставляют на 1–
2 суток для обезвоживания.
4. Препаровальной иглой или пипеткой переносят завязи на предметное
стекло в каплю глицерина. С помощью препаровальных игл или микроигл
(в зависимости от размера объекта) из завязей выделяют семязачатки.
5. Иглой переносят семязачатки на новое предметное стекло в каплю
просветляющей жидкости. С двух сторон капли размещают кусочки покровного стекла, которые будут выполнять функцию подпорок, предотвращая
раздавливание семязачатков под тяжестью покровного стекла. Закрывают
покровным стеклом.
Анализируют препарат с помощью фазово-контрастного микроскопа.
Вариант 3
В некоторых случаях (например, при изучении особенностей постсингамного развития) интегументы семязачатков препятствуют получению четкого изображения генеративных структур. Улучшить качество препарата мож-
48
Рис. 9. Приготовление препарата семязачатков табака методом просветления тканей: а –
очищенная от интегументов завязь табака; б – перенос завязи в пробирку со смесью
глицерина и ацетокармина (5 : 1); в – перенос завязи на предметное стекло в каплю просветляющей жидкостью Герра; г – отделение с помощью препаровальных игл
семязачатков от плаценты; д – добавление просветляющей жидкости к семязачаткам;
е – просветленные семязачатки табака
но, удалив часть соматических клеток семязачатка по следующей методике
(Юдакова, 1999; Юдакова и др., 2012).
1. Зафиксированные цветки промывают в течение 1 сут проточной водой.
49
2. Переносят промытые цветки на предметное стекло в каплю дистиллированной воды. С помощью препаровальных игл из цветков выделяют
завязи, а из них семязачатки.
3. Помещают выделенные семязачатки в пробирки Эппендорфа с ацетокармином, оставляют на 1 сут.
4. Окрашенные семязачатки переносят на предметное стекло в каплю
45% уксусной кислоты. Нагревают стекло над пламенем спиртовки до интенсивного выделения паров. При этом необходимо следить за тем, чтобы
раствор не закипал. Процедуру нагревания повторяют несколько раз.
5. Удаляют уксусную кислоту фильтровальной бумагой и наносят каплю
глицерина. Микроиглами снимают верхние интегументы семязачатка.
6. Препаровальной иглой или пипеткой переносят семязачатки на чистое
предметное стекло в каплю жидкости Герра. Закрывают покровным стеклом.
Стекло кладут на «подпорки», сделанные из кусочков поломанного покровного стекла. Оставляют для просветления не менее чем на 1 сут.
Препарат анализируют с помощью фазово-контрастного микроскопа.
7. МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ
ПОСТОЯННЫХ МИКРОТОМНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Метод приготовления постоянных микротомных препаратов является
классическим и универсальным методом гистологического и цитоэмбриологического анализа растений. Область его применения довольно обширна.
В ботанике его используют для анализа плоидности и кариотипа растений,
изучения особенностей строения и развития их генеративных и вегетативных
органов и структур.
7.1. Заливка материала в парафин
Для приготовления микроскопических срезов зафиксированный материал
необходимо прежде всего заключить в плотную среду. В качестве такой среды
в микротехнике чаще всего применяют парафин или смесь воска и парафина.
Заключение в парафин производят в три этапа:
1) обезвоживание объекта путем постепенной замены воды спиртом;
2) помещение объекта в растворитель парафина – путем постепенной замены спирта растворителем (хлороформом, толуолом или ксилолом);
3) заключение объекта в парафин путем замещения растворителя парафином.
Зафиксированный объект помещают в небольшой стеклянный сосуд (пенициллиновый пузырек и т. п.). Растворы в сосуде меняют в следующей
последовательности:
50