Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методы микроскопического анализа в ботанике. Учебно-методическое пособие для студентов биологического факультета, обучающихся по направлению подготовк.pdf
Саратовский национальный исследовательский государственный
университет имени Н. Г. Чернышевского
О. И. Юдакова
М Е Т О Д Ы
МИКРОСКОПИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
В БОТАНИКЕ
Учебно-методическое пособие
для студентов биологического факультета,
обучающихся по направлению подготовки бакалавриата
06.03.01 Биология
Саратов
Издательство Саратовского университета
2023
УДК
581.3(075.8)
ББК
284.06.03
Ю16
Юдакова, О. И.
Ю16
Методы микроскопического анализа в ботанике : учебно-методическое пособие для студентов биологического факультета,
обучающихся по направлению подготовки бакалавриата 06.03.01
Биология [Электронный ресурс] / О. И. Юдакова. – Саратов :
Издательство Саратовского университета, 2023. – 60 с. : ил. – URL:
https://books.sgu.ru/tutorials/978-5-292-04839-8. – Имеется печатный
аналог.
ISBN 978-5-292-04839-8 (online)
ISBN 978-5-292-04838-1 (print). – Текст: непосредственный.
DOI: 10.18500/978-5-292-04839-8
В пособии приводятся общие сведения об истории развития микроскопии, типах микроскопов, устройстве современных световых микроскопов и правилах работы
с ними. Подробно изложены методики приготовления микроскопических препаратов
для проведения кариологического анализа растений и изучения структуры и развития
их вегетативных и генеративных органов на тканевом, клеточном и субклеточном
уровнях. Описаны рецептуры приготовления наиболее часто используемых фиксаторов
и красителей.
Для студентов, обучающихся по направлению подготовки бакалавриата 06.03.01
Биология, аспирантов и преподавателей.
биологического факультета Саратовского национального исследовательского
государственного университета имени Н. Г. Чернышевского
(утвержден Ученым советом Саратовского национального исследовательского
государственного университета имени Н. Г. Чернышевского,
ISBN 978-5-292-04839-8 (online)
ISBN 978-5-292-04838-1 (print)
Печатается по решению Ученого совета
Р е ц е н з е н т ы :
доктор биологических наук, профессор В. А. Болдырев
доктор биологических наук, профессор С. А. Степанов
Работа издана по тематическому плану 2023 года
протокол № 12 от 20 декабря 2022 года)
©©Юдакова О. И., 2023
Саратовский университет, 2023
УДК 581.3(075.8)
ББК 284.06.03
ПРЕДИСЛОВИЕ
Одной из важных компетенций современного специалиста в области
ботаники и репродуктивной биологии растений является владение им разнообразными методами микроскопического анализа структур и органов
растений. На биологическом факультете Саратовского национального исследовательского государственного университета имени Н. Г. Чернышевского (СГУ) при подготовке бакалавров по направлению 06.03.01 Биология
данная компетенция реализуется в ходе изучения раздела «Репродуктивная
биология растений» дисциплины «Большой практикум». Целью данного
раздела практикума является знакомство студентов с методами исследования развития и строения растений на клеточном и субклеточном уровнях.
В задачи практикума входят:
1) освоение студентами методов подготовки биологического материала для микроскопического анализа, методов приготовления фиксаторов, красителей и микроскопических препаратов;
2) развитие умения правильно ориентироваться и выбирать метод исследования, необходимое оборудование и реактивы;
3) формирование практических навыков самостоятельной работы
на лабораторном оборудовании.
Программа большого практикума включает знакомство студентов как
с классическими методами приготовления постоянных препаратов, так и с
различными ускоренными методами анализа вегетативных и генеративных
структур и органов растений, включая методики, ранее разработанные
сотрудниками СГУ. Экспресс-методы позволяют значительно увеличить
объем исследуемого материала, что имеет важное значение при статистической обработке данных и при изучении явлений, которые происходят
с низкой частотой.
1. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Человеческий глаз имеет предел разрешения и детализации объектов:
в среднем на расстоянии 20–30 см он может различить в виде точки
предмет размером 0,07–0,08 мм. Для преодоления природного ограничения человеческого зрения используются микроскопы, которые позволяют
исследовать объекты крайне малых размеров.
Микроскопический анализ, или микроскопия (греч. micros – малый,
skopéo – смотрю) – это совокупность методов исследования объектов с по-
мощью микроскопов различных типов. В настоящее время в арсенале
исследователей имеются самые разнообразные типы микроскопов: световые, фазово-контрастные, люминесцентные, конфокальные, мультифотонные, электронные. В ботанике и репродуктивной биологии растений микроскопы используются для изучения морфологии, анатомии и топографии
структур и органов растений, а также для выявления локализации отдельных химических веществ в растительных клетках и тканях.
1.1. Краткая история развития микроскопии
Среди историков науки отсутствует единое мнение о том, кто изобрел
микроскоп. В 1538 г. итальянский врач Джироламо Фракасторо первым
предложил комбинацию из двух линз для того, чтобы достичь большего
увеличения. В 1590 г. братья (по другим данным, отец и сын) Ганс и Захарий Янсен сконструировали прибор, состоящий из трех железных трубок,
входящих друг в друга, и простых очковых линз (рис. 1, а). Ряд исторических документов свидетельствует о том, что двухлинзовые (сложные)
микроскопы с двумя выпуклыми линзами (объектив и окуляр) впервые появились в Англии и Голландии в 1617–1619 гг. В этот период микроскопы
изготавливал голландский оптик Корнелиус Якобсон Дреббель. Однако являлся ли он сам изобретателем этих микроскопов доподлинно не известно.
Первенство в изобретении сложного микроскопа некоторые исследователи приписывают Галилео Галилею. В 1609 г. Г. Галилей обнаружил,
что созданная им зрительная (подзорная) труба в раздвинутом состоянии
позволяет сильно увеличивать мелкие предметы. С учетом выявленной
особенности он сконструировал прибор для наблюдения объектов малых
размеров, состоящий из положительной и отрицательной линз. В 1624 г.
Галилей усовершенствовал свою модель, используя для ее изготовления
4
более короткофокусные линзы (см. рис. 1, б). Свой первый составной микроскоп Г. Галилей первоначально назвал «оккиолино» (итал. occhiolino –
маленький глаз). Через год, в 1625 г., его друг врач и ботаник Джованни
Фабер предложил для нового изобретения термин «микроскоп» (др. греч.
μικρός «маленький» + σκοπέω «смотрю»).
Рис. 1. Световые микроскопы: а – конца XVI в. (изобретатель Захарий Янсен); б – начала
XVII в. (изобретатель Галилео Галилей); в – середины XVII в. (изобретатель Роберт Гук);
г – XVIII в.; д – XIX в.; е – начала XX в.; ж – современный учебный
Первые микроскопы характеризовались низкой разрешающей способ-
ностью, т. е. способностью давать чёткое изображение двух близко расположенных точек как отдельных объектов. Микроскопы создавали увеличенное, но довольно расплывчатое изображение предмета. Это послужило
причиной того, что продолжительное время микроскопы считали забавными игрушками и практически не использовали для научных исследований.
Одним из первых в научных целях микроскоп стал применять английский физик Роберт Гук. В 1665 г. он усовершенствовал этот оптический
прибор (см. рис. 1, в), поместив между объективом и окуляром третью
двояковыпуклую линзу, в результате чего значительно увеличилась разрешающая способность микроскопа. Изображение стало более отчетливым.
5
В след за Р. Гуком с помощью микроскопа живые объекты стали изучать
и другие ученые XVII в.: Антонио Левенгук, Марчелло Мальпиги, Неемия
Грю и Ян Сваммердам.
В XVIII в. улучшение качества изображения микроскопов было достигнуто за счет повышения качества стекла линз (см. рис. 1, г). В 1729 г.
английский юрист Честер Мур Холл изготовил первую ахроматическую
линзу, которая пропускала свет, не разделяя его на составляющие цвета.
В 1770 г. голландские оптики Ян и Харманус ван Дейлы создали первый
ахроматический объектив, а в 1774 г. английский изобретатель Бенджамин
Мартин применил в микроскопе систему ахроматических линз, состоящую
из неодинаковых по дисперсии света сортов оптического стекла. Положительную линзу изготавливали из крона – бесцветных оптических стёкол, которые отличаются большими (более 50) значениями коэффициента средней
дисперсии, а отрицательную – из флинта, бесцветных оптических стёкол
с малыми (менее 50) значениями коэффициента средней дисперсии. Изобретение линз без хроматических аберраций сделало микроскоп ценным
инструментом научных исследований.
До 1870-х гг. микроскопы производили только по индивидуальному
заказу (см. рис. 1, д). Из-за недостатка теоретических знаний о формировании изображения в оптических приборах бытовало мнение о том, что
качество микроскопа определяется только опытом и мастерством его конкретного изготовителя. В 1873–1874 гг. немецкий физик-оптик Эрнст Аббе
установил, что разрешение микроскопа зависит от числовой апертуры объектива (NA), равной произведению синуса половины угла светового конуса,
попадающего в объектив, и показателя преломления среды, находящейся
между предметным стеклом и фронтальной линзой объектива:
NA = n × sin(α),
где
NA
– числовая апертура;n– показатель преломления окружающей
среды;α– половина угла светового конуса, который попадает в объектив.
Чем больше числовая апертура, тем больше света попадает в объектив,
и тем больше деталей рассматриваемого объекта видно в микроскоп. Когда
в объектив попадает больше света, изображение становится ярче.
Теория формирования изображения в микроскопах, разработанная
Э. Аббе, создала научную базу для масштабного производства оптических
инструментов (см. рис. 1, д). Были разработаны стандарты, которые
в дальнейшем применялись многими производителями.
В 1853 г. американский профессор химии Джон Леонард Ридделл
спроектировал бинокулярный микроскоп с одним объективом и системой
призм. Призмы были расположены так, что правый глаз получал свет
только от правой половины объектива, а левый глаз – от левой половины
объектива. Таким образом была достигнута трехмерность изображения.
6
В 1878 г. Э. Аббе совместно с английским инженером-механиком
Джорджом Стефенсоном изготовили масляный иммерсионный объектив,
что позволило увеличить разрешающую способность микроскопа. Э. Аббе также высказал идею о возможности использования ультрафиолетовых
лучей для повышения разрешающей способности микроскопов. Эта идея
была реализована в 1904 г. в конструкции микроскопа, созданного сотрудниками фирмы «Карл Цейсc» Р. Келером и М. Рором.
В 1934 г. голландский физик Фриц Цернике открыл фазово-контрастный метод, при котором сдвиг фаз световой волны трансформируется в контраст интенсивности. Прозрачные объекты не поглощают свет, но изменяют фазу световых волн, невидимых человеческим глазом. В 1940-х гг.
открытие Ф. Цернике было использовано для создания фазово-контрастных микроскопов, которые стали широко применяться в биологических
и медицинских исследованиях.
Основным ограничением возможностей светового микроскопа является длина волны электромагнитного излучения светового диапазона. Такие
микроскопы не позволяют видеть объекты размером менее 1 мкм, т. е.
объекты, размеры которых равны или меньше длины световой волны. Новый этап в развитии микроскопии начался с момента открытия возможности использования вместо видимого света потока движущихся электронов.
В 1920-х гг. Х. Буш обнаружил, что с помощью электрических и магнитных полей можно формировать электронные изображения. В 1931 г.
Р. Руденберг получил патент на просвечивающий электронный микроскоп.
В 1932 г. М. Кнолль и Э. Руска сконструировали просвечивающий электронный микроскоп, применив для фокусировки электронов магнитные
линзы. В конце 1930-х гг. фирма «Сименс-Хальске» в Германии приступила к промышленному изготовлению обычного просвечивающего электронного микроскопа (ОПЭМ) с разрешением 100 нм. В конце 1940-х гг.
такие приборы стали выпускать и другие компании.
Устройство электронных микроскопов во многом аналогично световому микроскопу, только для освещения объекта вместо светового луча в нем
используется пучок электронов, источником которых служит нагреваемый
катод из вольфрама или гексаборида лантана. Проецируется изображение
объекта на люминесцентный экран или фотографическую пластинку. Разрешающая способность ОПЭМ определяется эффективной длиной волны
электронов. Современные электронные микроскопы достигают разрешающей способности в 0,17 нм, что позволяет различать отдельные атомы
в кристаллах.
В 1950-х гг. был разработан растровый (сканирующий) электронный
микроскоп (РЭМ), а в 1980-х гг. – растровый туннельный микроскоп (РТМ).
Эти три вида микроскопов дополняют друг друга в исследованиях структур
и материалов разных типов.
7
1.2. Классификация микроскопов
В основу различных классификаций микроскопов положены разные
характеристики: строение оптической системы, способы освещения объекта, методы контраста.
Выделяют следующие виды микроскопов: световые, поляризационные,
люминесцентные, лазерные конфокальные, мультифотонные и электронные.
Световой микроскоп – это оптический прибор, который использует
видимый свет и систему линз для увеличения изображения объекта. Оптические микроскопы являются старейшим типом оптических приборов
для получения увеличенных изображений объектов. Принцип их работы
может быть основан на прохождении через систему линз как прямого, так
и отраженного луча света.
П о с п о с о б а м о с в е щ е н и я различают световые микроскопы:
1) проходящего света, в которых изображение формируется светом,
проходящим через объект;
2) падающего (отраженного) света, в которых изображение формируется отраженным от поверхности объекта светом.
П о с т р о е н и ю о п т и ч е с к о й системы различают:
1) прямые микроскопы, у которых объективы, насадка и окуляры располагаются над объектом (рис. 2, а);
2) инвертированные микроскопы, у которых объективы располагаются под исследуемым объектом (см. рис. 2, б). Такие микроскопы
позволяют работать с достаточно крупными объектами, такими как
чашки Петри и другие сосуды с культивируемыми клетками;
3) стереомикроскопы, имеющие в своей конструкции два объектива,
расположенных под углом, благодаря чему создается трехмерное
изображение исследуемого объекта (см. рис. 2, в). В стереомикроскопах, как и в прямых микроскопах, объект располагается под
оптической системой. Стереомикроскопы используют для изучения
относительно крупных и выпуклых микрообъектов (частей растений, грибов, колонии микроорганизмов).
П о м е т о д а м к о н т р а с т а выделяют микроскопы:
1) светлого поля, у которых более темный объект выделяется на светлом фоне;
2) темного поля, у которых светлый объект или его краевые структуры выделяются на темном фоне. В темнопольной микроскопии
конденсатор предназначен для формирования «полого» конуса света. Объектив располагается в темной полости этого конуса, а свет
распространяется вокруг объектива. Темнопольная микрокопия характеризуется большей разрешающей способностью по сравнению
со светлопольной, однако позволяет видеть лишь контуры клеток.
8
Рис. 2. Современные световые микроскопы с разными типами конструкции оптической
системы: а – стереомикроскоп; б – прямой; в – инвертированный
Основными характеристиками любого микроскопа являются:
1) разрешающая способность – минимальное расстояние между дву-
мя точками предмета, которые изображаются как раздельные. Обычно в световых микроскопах используются источники освещения
в видимой области спектра (400–700 нм), поэтому максимальное
разрешение микроскопа в этом случае может быть не выше 200–
350 нм (0,2–0,35 мкм);
2) общее увеличение – произведение собственного увеличения окуляра
и объектива;
3) контраст изображения – различие между яркостью изображения
и яркостью фона. Изображение нельзя уловить ни глазом, ни фотопластинкой в том случае, если указанное различие составляет менее
3–4%.
Современные световые микроскопы обеспечивают увеличение
до 2000–3000 раз, что позволяет изучать живые объекты на клеточном
уровне. Изображение, полученное с помощью микроскопа, может быть
9
захвачено светочувствительной фотокамерой для создания микрофотографий и проведения микрокиносъемки. Фотокамера монтируется
либо вместо одного из окуляров, либо у тринокулярных микроскопов
в отдельный оптический порт. Возможности светового микроскопа
ограничены волновой природой света.
Фазово-контрастный микроскоп – оптический прибор, в котором
сдвиг фаз электромагнитной волны трансформируется в контраст интенсивности. Благодаря сдвигу фаз прозрачные, неконтрастные объекты, невидимые при обычной световой микроскопии, становятся контрастными и видимыми. Изображение объекта может быть темным на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или, наоборот, светлым на темном фоне (негативный контраст).
Такие микроскопы используются для получения высококонтрастных
изображений прозрачных объектов, таких как тонкие неокрашенные фрагменты тканей, клетки и субклеточные структуры, а также более крупные
кусочки тканей и даже целые небольшие органы растений (семязачатки,
завязи и др.), обработанные просветляющей жидкостью, которая делает
их прозрачными. Одним из основных преимуществ фазово-контрастной
микроскопии является возможность исследовать структуру живых клеток
и динамику протекающих в них биологических процессов, а также структуру целых фиксированных просветленных многоклеточных структур и органов растений.
Люминесцентный (флюоресцентный) микроскоп – это световой
микроскоп, у которого в качестве источника света используется ртутнокварцевая или галогеновая кварцевая лампа. Она излучает ультрафиолетовый или синий свет, необходимый для возникновения люминесценции –
нетеплового свечения вещества вследствие поглощения им энергии возбуждения. Способностью к люминесценции обладает ряд природных и синтетических веществ (флюорохромов). Под воздействием лучей с определен-
ной длиной волны они могут светиться или изменять свою окраску. Люминесценция, которая присуща живым организмам, называется первичной
люминесценцией, а появляющаяся после обработки объекта флюорохромами – наведенной или вторичной люминесценцией.
Люминесцентные микроскопы оснащены системой светофильтров,
включающей пропускающий, теплозащитный и запирающий фильтры.
Пропускающий фильтр размещают непосредственно перед источником
света. Он пропускает только ультрафиолетовые лучи и отсекает остальную
часть спектра. Теплозащитный фильтр защищает оптику и препараты
от перегрева. Третий, запирающий фильтр находится на окуляре.
Он поглощает ультрафиолетовое излучение и пропускает только свет
люминесценции.
Люминесцентная микроскопия увеличивает контрастность изображения, дает возможность различить отдельные клеточные структуры. В бо-
10