Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Медицинская энзимология. Лабораторный практикум

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

06.09.2026

Размер:

1 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 7 89 / 129 10 11 12 > Следующая >>>

13. Приведите примеры действия лекарственных веществ как

конкурентных ингибиторов.

14. Дайте характеристику неконкурентным ингибиторам фер-

ментов.

15. Как изменяется константа Михаэлиса и максимальная ско-

рость ферментативной реакции при неконкурентном ингибировании? Объясните причину таких изменений.

16. Нарисуйте график Михаэлиса-Ментен для неконкурентного

ингибирования.

17. Нарисуйте график Лайнуивера-Берка для неконкурентного

ингибирования.

18. Приведите примеры веществ, являющихся неконкурентны-

ми ингибиторами.

19. Применение ингибиторов в энзимологии и медицине.

20. Ретроингибирование.

Рекомендуемая литература

Основная: 1, 2

Дополнительная: 2-10

Интернет-ресурсы: 1-9

ТЕМА 7. МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ

15. Исследование иммобилизованных ферментов

Цель занятия: изучить методы иммобилизации ферментов и исследовать активность иммобилизованных ферментов.

Формируемые компетенции: ОК-1, ОПК-5, ОПК-6, ОПК-7.

Теоретическая часть

Иммобилизованные ферменты – это препараты ферментов, молекулы которых связаны с матрицей или носителем, сохраняя при этом свои каталитические свойства. Существуют два принципиально различных метода иммобилизации ферментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентных связей между ними (химические методы иммобилизации). Иммобилизованные ферменты отличаются от нативных большей стабильностью, многократностью использования, а также, практически всегда, в несколько раз большей ферментативной активностью.

Иммобилизованные ферменты применяются в биореакторах различных типов. Другой областью довольно широкого применения иммобилизованных ферментов является разработка на их основе биосенсоров. Биосенсорами называют устройства, включающие биологический материал (фермент, культуру клеток, микроорганизмы и т.д.) и средства измерения реакции (отклика) этого элемента на изменение качественного состава среды. Анализ литературных данных свидетельствует о значительном расширении области применения иммобилизованных ферментов в биотехнологии в качестве катализаторов многоразового использования.

1. Иммобилизация амилазы

Материалы исследования и реактивы Сорбент; амилаза, крах-

мал, 0,5% раствор; Раствор Люголя, Na2HPO4, Лимонная кислота, NaCl, 1% раствор; HCl, 5% раствор; NaOH, 10% раствор; Na2S2O3.

Приборы и посуда: Термостат; Колбочки на 50 мл; Пробирки химические; пипетки; Воронки диаметром 3-5 см; Фильтры бумажные; Карандаши по стеклу; Пипетки на 1 и 5 мл. Бюретка

Ход работы

К 0,5–1 г сорбента приливают 1-2 мл раствора амилазы и оставляют на 2 ч, периодически перемешивая. Концентрация рас-

твора амилазы составляет 15-20 мг/мл. По истечении времени надосадочную жидкость сливаем. Сорбент промываем дистиллированной водой, для чего заливаем сорбент водой, перемешиваем и после осаждения осадка декантируем надосадочную жидкость. Промывание проводим трижды.

Проводим реакции на определение активности иммобилизованной амилазы по методике, описанной ниже. Только вместо раствора амилазы берем 200-300 мг иммобилизованного адсорбента. Для кон- трольного опыта используется не иммобилизованный сорбент.

2. Определение оптимума рН действия амилазы

Влияние рН на активность ферментов объясняется тем, что белковая молекула фермента является амфотерным полиэлектролитом, каталитический эффект которого зависит от степени ионизации функциональных групп, которые входят в активный центр фермента. Влияние рН на активность ферментов можно показать на примере определения активности амилазы.

Оптимум рН действия амилазы определяют при взаимодействии ее с крахмалом при различных значения рН среды. О степени расщепления крахмала судят по реакции его с раствором Люголя во времени.

Материалы исследования и реактивы: 0,5% раствора крах- мала и амилазы, разведенной в 10 раз, Na2HPO4 0,1М раствор лимонной кислоты, 0,1% йод.

Приборы и посуда: фарфоровая или стеклянная пластинка, термостат, штатив, пробирки.

Ход работы

Перед началом работы следует проверить исходную активность амилазы, для чего смешивают равные количества (по 10 капель) 0,5% раствора крахмала и амилазы, разведенной в 10 раз.

Через каждые 2 мин отбирают по 1 капле смеси на фарфоровую или стеклянную пластинку и смешивают с каплей раствора йода. Крахмал должен расщепиться полностью (до желтой окраски с йодом) приблизительно за 10 мин. Если расщепление происходит быстрее, то разведенную в 20 раз амилазу нужно развести еще в 3 или 4 раза.

Готовят буферные растворы, имеющие рН от 5,6 до 8, для чего в 7 пронумерованных пробирок наливают 0,2М раствор Na2HPO4 и 0,1М раствор лимонной кислоты в количествах, указанных в таблице; затем в каждую пробирку добавляют по 10 капель 0,5% раствора крахмала и по 10 капель амилазы, разведенной в 100 раз.

Таблица

№

про-

бирки

Количество

0,2М

Na2HPO4,мл

Количество

0,1М лимон-

ной кислоты,

мл

рН

среды

Количе-

ство

крахма-

ла, капли

Количе-

ство ами-

лазы 1:100,

капли

Полу-

ченная

окраска с

йодом 1 0,58

0,42

5,6

10 2

0,63

0,37

6,0

10 3

0,69

0,31

6,4

10 4

0,77

0,23

6,8

10 5

0,87

0,13

7,2

10 6

0,94

0,06

7,8

10 7

0,97

0,03

8,0

Приготовление буферных растворов

Содержимое пробирок тщательно перемешивают и ставят в термостат при 37С на 10 мин. После этого из 4-ой пробирки, величина рН которой предполагается оптимальной, отбирают несколько капель смеси и проделывают реакцию с йодом. Если получают синее окрашивание, то реакцию с йодом повторяют через каждые 5 мин до тех пор, пока не получат красное или оранжевое окрашивание.

Во все пробирки добавляют по 1 капле 0,1% раствора йода, перемешивают и отмечают окрашивание. Оптимальная величина рН для амилазы будет в той пробирке, в которой крахмал полностью расщепляется, т.е. при реакции с йодом получают желтую окраску. Фиолетовое, красно-фиолетовое и бурое окрашивание доказывает меньшую степень расщепления крахмала.

3. Количественное определение активности амилазы

Определение активности раствора амилазы основано на нахождении максимального разведения, при котором происходит расщепление крахмала.

Материалы исследования и реактивы: раствор амилазы, фосфатный буфер, крахмал, НCl, раствор Люголя, амилаза, 1% раствора NaCl, 0,1н. раствора I2, 10% раствор NaOH, Na2S2O3.

Приборы и посуда: пробирки, штатив.

3.1. Экспресс-метод определения амилазы Ход работы

К 0,1 мл раствора амилазы добавляют 4 капли фосфатного буфера рН 6,8 и 0,2 мл раствора крахмала. Смесь тщательно перемешивают и оставляют стоять 5 мин при комнатной температуре. По-

сле этого добавляют 1 каплю подкисленного НCl раствора Люголя и наблюдают окраску в течение 15 сек. Синее окрашивание свидетельствует о нормальном содержании амилазы, желтое или коричневое – о повышенной активности фермента. В случае образования зеленой окраски активность следует проверить другим методом.

3.2. Определение активности амилазы по приросту мальтозы

Данный метод определения активности амилазы основан на измерении прироста количества мальтозы, которая образуется при действии амилазы на полисахариды – крахмал и гликоген.

Крахмал и гликоген не обладают восстанавливающей способностью, тогда как продукт их гидролиза – мальтоза – обладает этим свойством. Реакция идет по уравнению:

1) (C6H10O5)n + H2O → C12H22O11;

2) C12H22O11 +I2 + 3NaOH → C11H21COONa +2NaI + 2H2O

В результате реакции йод, добавленный в реакционную смесь, в щелочной среде восстанавливается под действием образующейся мальтозы, превращаясь в бесцветное соединение – соль NaI.

Путем титрования определяют количество йода, эквивалентное данной величине мальтозы, и рассчитывают активность амилазы.

Ход работы

В две колбочки (опытную и контрольную) вносят по 0,1 мл амилазы, разведенной в 5 раз, по 0,5 мл фосфатного буфера рН 6,8 и по 0,1 мл 1 % раствора NaCl. В контрольную пробу вносят 0,5 мл 5 % раствора HCl и кипятят 5 мин.

В обе колбочки наливают по 2,5 мл 2 % раствора крахмала, перемешивают и ставят на 30 мин в термостат при 37С.

Спустя 30 мин в опытную колбочку вносят 0,5 мл 5 % раствора HCl и нагревают до кипения. Затем в обе колбочки добавляют по 1,5 мл 0,1н. раствора I2 и по каплям, все время перемешивая, добавляют 0,5 мл 10 % раствора NaOH.

Оставляют пробы стоять 15 мин, а затем в обе колбочки вносят по 1,0 мл 5 % раствора HCl и выделившийся I2 титруют 0,05 н. раствором Na2S2O3 до исчезновения сине-фиолетового окрашивания.

Рассчитывают активность амилазы: 1 мл 0,05н. раствора I2, эквивалентный 1 мл 0,05н. раствора Na2S2O3, соответствует 8,57 мг мальтозы. Количество образовавшейся мальтозы С равно:

С = (B – D)∙8,57,

где B – количество 0,05н. раствора Na2S2O3, пошедшее на титрова-

А 

ние контрольной пробы;

D – количество 0,05н. раствора Na2S2O3, пошедшее на титрова- ние опытной пробы;

8,57 – коэффициент поправки на 0,05н. раствора Na2S2O3.

Активность амилазы А будет равна:

где 6 – разведение пробы.

4. Исследование способности ферментов к адсорбции

Особенное распространение получили так называемые иммобилизованные ферменты, которые фиксированы, закреплены на каком-либо носителе. В качестве таких носителей применяют разнообразные вещества – целлюлозу и ее производные, частички пористого стекла, гель полиакриламида, сефадексы, нейлон, коллодий, крахмал, алюмосиликаты, окислы металлов и др. Иммобилизация приводит к существенному изменению таких свойств фермента, как стабильность, специфичность, кинетические характеристики.

Материалы исследования и реактивы: слюна, активирован- ный уголь, 1% раствор крахмала, слюна.

Приборы и посуда: термостат, штатив, пробирки.

Ход работы

Разбавить 3 мл слюны в 3 раза и разлить поровну в 2 пробирки. Первую оставить без изменений, а во вторую внести 0,2 г измельченного активированного угля и встряхивать около 5 мин. Затем содержимое обеих пробирок отфильтровать и добавить в каждую по 2 мл 1% раствора крахмала. Поставить пробирки в термостат при 37С на 20-30 мин для гидролиза крахмала. Проделать с содержимым пробирок пробу Фелинга. Сделать вывод.

5. Получение липосом

Метод основан на экстракции горячим этанолом фосфатидилхолина из яичного желтка с последующим осаждением ацетоном и на способности фосфолипидов образовывать на поверхности раздела двух фаз (вода – липиды) тонкий бимолекулярный липидный слой сферической формы.

Материалы исследования и реактивы: Спирт 96%; ацетон; фосфатный буфер. Яичный желток; спиртовый раствор фосфатидилхолина.

Приборы и посуда: Пробирки, водяная баня, термометр, бумажные фильтры, микроскоп, предметные стекла.

Ход работы

Поместить в пробирку 0,5-1,0 г (1/6 часть) яичного желтка, добавить 5,0 мл кипящего спирта (для этого спирт предварительно помещают в водяную баню с температурой 75-78С), перемешивать содержимое пробирки 8-10 мин.

По окончании извлечения жидкость фильтруют через бумажный фильтр. С фильтратом проделывают реакцию на фосфатидилхолин с ацетоном, для чего к 10 каплям ацетона прибавляют по каплям фильтрат. Постепенно жидкость мутнеет вследствие осаждения нерастворимого в ацетоне фосфатидилхолина.

К 3-4 мл полученного ранее спиртового раствора фосфатидилхолина добавляют равный объем фосфатного буфера с рН 6,8 и интенсивно диспергируют (встряхивают) в течение не менее 10 мин.

Каплю полученной жидкости – взвеси липосом – наносят на предметное стекло и микроскопируют при малом увеличении (объектив №8). Наблюдают липосомы в виде везикул.

Задание: получить липосомы с ферментом и исследовать активность фермента капсулированного в липосомы.

Контрольные вопросы

1. Иммобилизированные ферменты. Их свойства.

2. Физический метод иммобилизации.

3. Химический метод иммобилизации

4. Применение иммобилизованных ферментов.

5. Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов.

6. Промышленное применение ферментов.

7. Укажите наиболее рациональные способы иммобилизации

ферментов.

8. Назовите особености биодеградируемых ферментных пре-

паратов.

9. Классификация носителей для ферментов.

Рекомендуемая литература

Основная: 1, 2

Дополнительная: 1-10

Интернет-ресурсы: 1-9

ТЕМА 8. ЗНАЧЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ В ДИАГНОСТИКЕ

И ПРОГНОЗЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ

16. Исследование ферментов слюны

Цель занятия: Изучить активность ферментов слюны.

Формируемые компетенции: ОК-1, ОПК-5, ОПК-6, ОПК-7.

Теоретическая часть

В составе слюны человека выделено более 100 ферментов. Набор ферментов слюны включает амилазу, лизоцим, гликолитические ферменты, гиалуронидазу, ферменты цикла трикарбоновых кислот, ферменты тканевого дыхания, щелочную и кислую фосфатазы, аргиназу, липазу, ферменты антиоксидантного действия и др.

1. Определение активности амилазы слюны (метод Вольгемута)

Метод заключается в том, что слюну разводят в определенной последовательности, после чего одно и то же крахмала приливают, находят наименьшее содержание фермента, которое полностью расщепляет все количество добавленного крахмала, затем производят расчет на 1 мл слюны.

Активность -амилазы выражают количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, которое может расщепить 1 мл неразведенной слюны при 37°С в течение 30 мин до стадии эритродекстрина. Рассчитывают количество слюны в последней пробирке с желтоватой окраской.

Материалы исследования и реактивы: раствор слюны, 0,1% раствора крахмала, вода, раствор йода.

Приборы и посуда: штатив, пробирки, пипетки, термостат.

Ход работы

В 10 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл воды. В первую добавляют 1 мл слюны, разведенной в 10 раз, перемешивают несколько раз, втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси из одной пробирки, переносят ее во вторую; из второй таким же образом в третью и т. д. до десятой пробирки, из последней пробирки 1 мл смеси выливают. В каждой последующей пробирке, таким образом, содержание фермента вдвое меньше, чем в предыдущей.

Во все 10 пробирок приливают по 1 мл воды и по 2 мл 0,1%

№

Разведение слюны

Окрашивание йодом

Активность амилазы

1:10 2 1:20 3 1:40 4 1:80 5 1:160 6 1:320 7 1:640 8 1:1280

1:2560

1:5120

раствора крахмала. Перемешивают, встряхивают пробирки и помещают в термостат при температуре 37С на 30 мин. Затем пробирки вынимают, охлаждают, во все добавляют по 1 капле раствора йода, перемешивают и отмечают окраску. Данные занести в таблицу 1.

Например, если с красно-бурой окраской жидкость была отмечена в 5 пробирке, где слюна разбавлена в 160 раз и куда было добавлено 2 мл 0,1 % раствора крахмала, то 1 мл неразбавленной слюны расщепил бы в 160 раз больше 0,1% раствора крахмала: 1/160 мл слюны расщепляет 2 мл – 0,1% раствора крахмала, 1 мл слюны расщепляет х мл 0,1% раствора крахмала, т. е. х = 2∙1:1/160 = 320 мл 0,1 % раствора крахмала. Следовательно, 1 мл неразбавленной слюны расщепляет за 30 мин при 37°С 320 мл 0,1% раствора крахмала. Условно это принимают за 320 единиц -амилазы по Вольгемуту. Результат принято изображать следующим образом: А 37º/30' = 320 ед.

Таблица 1

Определение активности амилазы

Крахмал и гликоген не обладают восстанавливающей способностью, тогда как продукт их гидролиза мальтоза – обладает этим свойством. Реакция идет по уравнению: (С6Н10О5)n + Н2О  С12Н22О11

В результате реакции йод, добавленный в реакционную смесь, в щелочной среде восстанавливается под действием образующейся

2. Количественное определение активности Амилазы по приросту мальтозы

С12Н22О11 + I2 + 3NaOH  С11Н21СOОNa + 2NaI + 2Н2О

мальтозы, превращаясь в бесцветное соединение – соль NaI. Путем титрования определяют количество йода, эквивалентное данной величине мальтозы, и рассчитывают активность амилазы.

Материалы исследования и реактивы: слюна, фосфатный

буфер, 1% раствор NaCl, 2% раствор крахмала, 5% НСl, 0,1 н раствор I2, 40% раствор NaOH, 0,05 н. раствор Na2S2O3.

Приборы и посуда: 2 колбы, термостат при 37С.

Ход работы

В две колбы (опытную и контрольную) вносят по 0,1 мл слю-

ны, разведенной в 5 раз, по 0,5 мл фосфатного буфера рН 6,8 и по 0,1 мл 1% раствора NaCl. В контрольную пробу вносят 0,5 мл 5% раствора НС1 и кипятят.

В обе колбы наливaют 2 мл 2% раствора крахмала, перемеши-

вают и ставят на 30 мин в термостат при 37С.

Спустя 30 мин в опытную колбу вносят 0,5 мл 5% НС1 и нагре-

вают до кипения. Затем в обе колбы, добавляют по 15 мл 0,1 н раствора I2 и по каплям, все время перемешивая, добавляют 0,5 мл 40% раствора NaOH.

Оставляют пробы стоять 15 мин, а затем в обе колбы вносят по

10 мл 5% раствора НС1 и выделившийся I2 титруют 0,05 н. раствором Na2S2O3 до исчезновения сине-фиолетового окрашивания.

Рассчитывают активность амилазы: 1 мл 0,05 н. раствора I2 эквивалентный 1 мл 0,05 н. раствора Na2S2O3, соответствует 8,57 мг мальтозы. Количество образовавшейся мальтозы

С = (B – D)∙8,57,

где В – объем 0,05 н. раствора Na2S2O3, пошедший на титрование контрольной пробы, мл;

D – объем 0,05 н. раствора Na2S2O3, пошедший на титрование опытной пробы, мл;

8,57 – коэффициент поправки на 0,05 н. раствора Na2S2O3.

Активность амилазы А будет равна:

А= С/n,

где n – разведение пробы.

3. Гидролиз крахмала α-амилазой слюны

α-Амилаза слюны относится к классу гидролаз. Специфическими субстратами α-амилазы являются полисахариды крахмал и гликоген. Для исследования действия α-амилазы слюны в качестве страта берут крахмал. Нерасщепленный крахмал образует с йодом

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 7 89 / 129 10 11 12 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]