Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Медицинская энзимология. Лабораторный практикум
.pdf
выдерживают для каждой отдельной пробы, а не для серии целиком, технически с водяной баней работать удобней.
5. Ни в коем случае нельзя изменять соотношение рабочий реагент/сыворотка. Его уменьшение в целях экономии может привести
к сужению линейной области определения в случае определения
активности фермента и к неполному превращению аналита в случае
ферментативных методов анализа, т. е. к получению заниженных
результатов. При увеличении соотношения рабочий реагент/сыворотка снижается чувствительность метода.
6. Также нельзя разбавлять рабочий реагент в целях экономии,
т. к. при этом условия реакции (концентрация буфера, активаторов
и т. д.) отклонятся от оптимальных, что приведет к занижению результатов анализа как в случае определения активности ферментов,
так и в случае определения аналитов ферментативными методами.
7. Если концентрация фермента или другого аналита в биологической жидкости превышает верхнюю границу линейности набора, то
исследуемую пробу необходимо разбавить строго в соответствии с
рекомендациями, изложенными в инструкции к набору (чем разбавлять и во сколько раз). Несоблюдение указаний может привести к серьезным ошибкам, т. к. в сыворотке присутствует огромное количество соединений, тем или иным образом влияющих на аналит и результат его определения (особенно это касается ферментов). Для получения точных и воспроизводимых результатов пробу вообще лучше не
разбавлять, тем более что активность некоторых ферментов, например
АлАТ и АсАТ, непропорционально уменьшается при разбавлении.
Однако не всегда линейная область определения набора позволяет
охватить весь диапазон физиологических концентраций аналита. Надо
стремиться разбавлять пробу минимально, желательно, в 2–3 раза
(особенно при определении активности ферментов) и не больше, чем
указано в инструкции. Разумеется, для разведения нельзя использовать
маленькие аликвоты (10–20 мкл); чтобы уменьшить ошибку разведения, лучше взять хотя бы 100 мкл пробы.
8. Фотометрирование следует проводить в указанном в инструкции диапазоне длин волн, отклонение может существенно
снизить чувствительность метода. В случае расчета концентрации
аналита или активности фермента по коэффициенту экстинкции
длина волны должна точно соответствовать указанной в инструкции. Так как коэффициент экстинкции – это оптическая плотность
раствора вещества с концентрацией 1 мкМ в кювете с толщиной
11
поглощающего свет слоя 1 см при данной длине волны, то для другой длины волны значение его будет иным и может значительно
отличаться.
9. Длина оптического пути кюветы для фотометрирования
должна соответствовать указанной в инструкции. Использование
кюветы с меньшей длиной оптического пути снизит чувствительность метода.
10. При построении калибровочных кривых необходимо делать
не менее 4–5 параллельных определений холостой пробы и каждого
стандартного образца указанной в инструкции концентрации. Строить калибровочную кривую следует для каждой серии набора,
а также при смене фотометрического оборудования.
11. Калибровочную пробу, используемую для расчета концентрации аналита или активности фермента, необходимо ставить для
каждой серии анализов в четырех параллелях.
12. Следует тщательно мыть посуду, пипетки, наконечники и
многократно ополаскивать их дистиллированной водой. Для мытья
можно использовать только моющие средства, не содержащие биодобавки, т. к. в их состав входят протеазы, которые даже в следовых количествах могут разрушить ферменты в реакционной смеси. Особенно
тщательно следует отмывать перекись водорода, используемую для
обеззараживания пробирок и наконечников. Н2О2 является одним из
продуктов сопряженных ферментативных реакций при определении
глюкозы, холестерина, триглицеридов и т.д. Поэтому наличие экзогенного пероксида водорода завысит результаты анализа.
13. Необходимо следить за качеством дистиллированной воды,
используемой в процессе анализа. Избыток некоторых ионов, входящих в ее состав, может ингибировать ферменты.
14. При работе с ферментативными наборами так же, как и при
работе с другими наборами реагентов, желательно, а при отборе
проб малых объемов (30–10 мкл) обязательно следует пользоваться
проверенными автоматическими микродозаторами. Наконечники к
ним лучше повторно не использовать, особенно те, которыми проводили отбор сыворотки и затем обеззараживали пероксидом водорода, по указанным выше причинам. При отборе калибратора использовать только новые наконечники.
15. Для получения достоверных результатов очень важен преаналитический этап. По литературным источникам доля ошибок доаналитического этапа в общем числе лабораторных ошибок составляет не
12
менее 50 %. На долю аналитического этапа приходится не более 20 %
ошибок, при этом значительная часть их связана с отсутствием стандартов на выполнение операций доаналитического этапа. На долабораторном этапе большое значение имеет процедура взятия крови у пациента, транспортировка в лабораторию, пробоподготовка и хранение
пробы до анализа. Неумелое взятие крови может привести к ложным
результатам. В качестве примера можно привести следующие факторы
доаналитического этапа, которые могут существенно повлиять на результаты определения активности ферментов. Так, продолжительный
веностаз может привести к гипоксии и увеличению проницаемости
мембран клеток крови, что скажется на активности ряда ферментов.
Другой негативный фактор – гемолиз; при длительном стоянии крови
появляющиеся активные радикалы кислорода и дефицит субстратов
приводят к порозности мембран эритроцитов. Гемолиз, освобождение
ферментов из лейкоцитов и тромбоцитов могут привнести заметные
изменения в активность ЛДГ, АсАТ, АлАТ, кислой фосфатазы в сыворотке. ЛДГ и кислая фосфатаза присутствуют в высоких концентрациях в тромбоцитах, поэтому активность этих ферментов в сыворотке
выше, чем в плазме. При свертывании крови в сыворотке появляются
ферменты из тромбоцитов, в частности кислая фосфатаза, поэтому при
работе с сывороткой рекомендуется как можно быстрее отделить ее от
сгустка.
Механические повреждения клеток крови (например, вследствие
выпускания крови из шприца в пробирку с силой или интенсивного
встряхивания при перемешивании) также могут сказаться на результатах определения активности ферментов. Хранение сыворотки также
неблагоприятно сказывается на результатах определения активности
многих ферментов (они занижаются), поэтому следует измерять активность ферментов в сыворотке в день взятия крови у пациента. Длительное хранение крови приводит к активации протеолиза, потери четвертичной структуры вследствие негативного влияния на SH-группы,
что сказывается на активности ферментов.
16. Следует строго соблюдать условия хранения ферментативных наборов и их компонентов, указанные в инструкции, т. к. ферменты – термолабильные катализаторы. Хранение их при более высокой температуре, например в комнате вместо холодильника, может привести к быстрой инактивации ферментов. Амилаза, липаза,
лейцинаминопептидаза (ЛАП), ГГТ, холинэстераза, кислая фосфатаза устойчивы при хранении, стабильность других ферментов ва-
13
рьирует. Многие ферменты можно хранить в замороженном состоянии и в виде лиофилизатов без потери активности, однако некоторые ферменты чувствительны к процедуре замораживания, их можно замораживать только после добавления стабилизаторов, сохраняющих их структуру. Это связано с тем, что вода при кристаллизации вызывает необратимые изменения в водородных связях белка. Например, уреаза при замораживании частично или полностью
инактивируются. Особенно чувствительны к процедуре замораживания ферменты, состоящие из нескольких субъединиц. Не допускается при хранении несколько раз замораживать и размораживать
пробы.
17. Следует регулярно проверять правильность и воспроизводимость результатов анализа по контрольным сывороткам, аттестованным соответствующими методами. В случае определения активности ферментов учитывать, каким рекомендациям соответствует
используемый метод.
2. Основные приёмы работы с биологическими объектами
Для исследования различных биохимических параметров in
vitro широко используются клетки и плазма крови, а также различные ткани экспериментальных животных. Наиболее часто в таких
экспериментах используются лабораторные животные – кролики,
крысы и мыши.
Прижизненное взятие крови у животных
Интактные и опытные кролики могут быть донорами до 2 лет.
Кровь берут из краевой вены уха кролика капельным методом.
На внутренней поверхности уха в середине сбривают шерсть на
участке 11 см вблизи локализиции краевой вены и протирают оголённую кожу спиртом.
1. Делают неглубокий поперечный надрез вены бритвой. К ме-
сту разреза подставляют пробирку и протирают его сухой стерильной ватой.
2. Если процедура сделана правильно и кролик спокоен, кровь
по каплям начинает собираться в пробирку. Кролика желательно
укрыть тканью, чтобы ему было тепло.
3. Обычно берут 10-20 мл крови без дополнительного введения
физиологического раствора с глюкозой. Если требуется большее
количество крови (50 мл), то после её взятия для восполнения поте-
14
ри жидкости необходимо ввести внутривенно физиологический
раствор.
4. По окончанию забора крови рану зажимают ватным тампоном до прекращения кровотечения. В случае глубокого надреза ушной вены и невозможности остановки кровотечения обычным способом используется тромбопластин.
Примечание: При заборе крови нужно чётко представлять,
какая именно составная часть крови будет использована для
проведения эксперимента. Для работы могут быть использованы
как сами клетки (ретикулоциты, эритроциты, лимфоциты,
тромбоциты), так и жидкая часть крови (сыворотка или же плазма
крови). !Сыворотка – это плазма крови, лишённая фибриногена!
В сыворотке крови фибриноген превращается в фибрин, в плазме
же этому превращению препятствует антикоагулянт (см. ниже).
Получение сыворотки, плазмы и эритроцитов крови
Для получения сыворотки забор крови осуществляется в чи-
стую сухую пробирку. Пробирку закрывают ватной пробкой и ста-
вят в термостат на 30 минут (36С).
1.Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки, вновь
закрывают ватной пробкой и ставят в холодильник (4С) на 12 ч.
2.Полученную сыворотку центрифугируют при 5000 g в течение 5 мин. Отделившаяся от осадка сыворотка должна быть прозрачной, желтоватого цвета (розовый цвет говорит о том, что в сыворотку попали лизированные эритроциты).
3.Сыворотку следует хранить при температуре не выше -20С.
При разморозках активность сыворотки резко падает, поэтому её
хранят небольшими порциями – аликвотами (0,2-0,5 мл) и размораживают один раз, используя в опытах по мере необходимости.
Для получения плазмы и клеток крови обязательным услови-
ем является использование консервантов крови ((гепарин, цитрат
натрия, динатриевая соль этилендиаминтетраацетата (трилон Б) или
раствор Олсвера)), чтобы воспрепятствовать образованию тромба.
Чаще всего, в качестве антикоагулянта используют гепарин. В центрифужную пробирку вносят несколько капель антикоагулянта
(примерное соотношение крови и гепарина 1/5) и равномерно распределяют его по дну и стенкам пробирки. Только после этого в
пробирку можно набирать кровь.
15
Гепаринизированную кровь центрифугируют 20 мин при 3000
об/мин. (1700g). После центрифугирования убирают слой плазмы и
тонкую белую лейкоцитарную пленку. Плазму отбирают отдельно и
сохраняют. Плазму следует хранить при температуре не выше 20С. При разморозках активность плазмы резко падает, поэтому её
хранят небольшими порциями – аликвотами (0,2-0,5 мл) и размораживают один раз, используя в опытах по мере необходимости.
Оставшуюся после отбора плазмы эритроцитарную массу трижды отмывают физиологическим раствором (0,9%-ным NaCl) и
центрифугируют по 15 мин при 3000 об/мин. (1700g). Супернатант
отбрасывают. Последнее центрифугирование проводят в течение 20
мин для более плотной упаковки клеток (Авраамова, Титова, 1978).
Приготовление гомогенатов тканей
Для получения гомогенатов ткани взвешиваются на электронных
весах и гомогенизируютя в физиологическом растворе с помощью стеклянного гомогенизатора в течение 5-10 мин (240-250 мг ткани + 5 мл
0,9% раствора NaCl). Все операции проводятся на холоде.
Гомогенат центрифугируют при 5-6 тыс. об/мин в течение 30 мин.
Полученный супернатант используется в дальнейших методиках.
Приготовление лизированных клеток
Клетки лизируют добавлением определённого объёма отмытых
от плазмы и упакованных клеток к рассчитанному объёму дист. воды, охлаждённой до 0С.
Для приготовления лизата клеток разведением в Х раз (или
1:(Х-1)) нужно 1 часть клеток добавить к (Х-1) частям дист. воды.
Например, для приготовления лизата клеток разведением в 10
раз (или 1:9) нужно 1 часть клеток добавить к 9 частям дист. воды.
Например, для приготовления лизата клеток разведением в 10
раз (или 1:9) и объёмом 20 мл нужно 2 мл клеток (1*2=2) добавить к
18 (9*2=18) мл дист. воды.
Контрольные вопросы
1. Общие правила работы с ферментами.
2. Правила хранения ферментативных препаратов.
3. Получение первых ферментативных препаратов.
4. Последние достижения в изучении ферментов.
5. Значение работ отечественных ученых в развитии энзимологии.
6. Биологическая роль ферментов.
16
7. Применение ферментов.
8. Основные приёмы работы с биологическими объектами.
9. Определение предмета энзимологии и ее задачи.
10. Связь энзимологии с фармацией и медициной.
11. Качественное отличие энзимов от неорганических катализа-
торов.
12. Объекты энзимологических исследований.
13. Методы и приборы используемые при ферментативных
анализах.
Рекомендуемая литература
Основная: 1, 2
Дополнительная: 2, 3, 5, 6, 10
Интернет-ресурсы: 1-9
17
ТЕМА 3. ФЕРМЕНТЫ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ.
КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА
3. Исследование дегидрогеназ
Цель занятия: Изучить ферменты дегидрогеназы.
Формируемые компетенции: ОК-1, ОПК-5, ОПК-6, ОПК-7.
Теоретическая часть
Дегидрогеназы одна из самых многочисленных подгрупп фер-
ментов, катализирующих реакции биологического окисления и восстановления, т. е. реакции, связанные с процессами дыхания, гликолиза и брожения; активность некоторых дегидрогеназ в сыворотке
крови служит дополнительным диагностическим тестом при ряде
заболеваний.
1. Обнаружение дегидрогеназ молока
Материалы исследования и реактивы: молоко, вода, раствор
формальдегида, раствор метиленового синего, масло.
Приборы и посуда: пробирки, штатив, водяная баня.
Ход работы
Пронумеруйте шесть пробирок. В пробирки 1 и 2 налейте по
5 мл свежего некипяченого молока, а в пробирку 3 – такое же количество холодного кипяченого молока. Воду в водяной бане нагрейте
до 37°С. Во все три пробирки добавьте по 0,5 мл (около 50 капель)
раствора формальдегида и по 5 капель раствора метиленового синего. Смесь станет голубой. В каждый флакон налейте немного масла,
чтобы образовался тонкий изолирующий слой на поверхности,
и поставьте пробирки 1 и 3 на водяную баню.
Пробирку 2 оставьте при комнатной температуре. Заметьте
время начала реакции и наблюдайте за изменением окраски растворов. Результаты нужно записать в тетрадь.
2. Обнаружение дегидрогеназ в дрожжах
Материалы исследования и реактивы: прессованные
дрожжи, вода, сахарный песок, краситель.
Приборы и посуда: пластмассоая или алюминиевая ложка,
пипетка, пробирки, ватный тампон на палочке, водяная баня.
Ход работы
Кусочек прессованных дрожжей разотрите на блюдце с двумя
чайными ложками кипяченой воды. Растирать лучше пластмассовой
18
или алюминиевой ложкой. Когда смесь станет однородной, внесите ее
Сукцинатдегидрогеназа
чистой пипеткой в две пробирки. Их надо предварительно вымыть с
мылом ватным тампоном на палочке, промыть водой и высушить.
Другой пипеткой добавьте в обе пробирки немного масла.
Пробирку 1 поставьте на пять минут в кастрюлю с кипящей водой и охладите до комнатной температуры. В обе пробирки добавьте по щепотке сахарного песка и осторожно взболтайте, чтобы сахар растворился. Третьей пипеткой введите в обе пробирки по 10–
15 капель раствора красителя. Наблюдайте за окраской раствора.
Опыт можно несколько усложнить, для этого понадобится больше
пробирок. Попробуйте изменять температуру раствора, брать разные
количества дрожжей и сахарного песка. Сделайте выводы.
3. Определение активности сукцинатдегидрогеназы
Сукцинатдегидрогеназа катализирует превращение янтарной
кислоты в фумаровую. Кофактором фермента является ФАД. Фермент прочно связан с внутренней мембраной митохондрий.
−
СOO–CH2–CH2–COO− + FAD –СOO-CH=CH-COO− + FAD2H
сукцинат фумарат
Материалы исследования и реактивы: мышечная кашица,
3 % раствор янтарной кислоты, 10 % NaOH, дистиллированная во-
да, 3 % яблочная кислота, 0,02 % раствора метиленовой сини.
Приборы и посуда: термостат, пробирки, штатив.
Ход работы
В 3 нумерованных пробирки помещают 3-4 мл мышечной кашицы и добавляют в первую – 1 мл 3% раствора янтарной кислоты,
нейтрализованной по лакмусу 10% раствором NaOH; во вторую –
1 мл дистиллированной воды; в третью – 1 мл 3% яблочной кислоты.
В каждую пробирку добавляют 2-3 капли 0,02% раствора метиленовой сини (до окрашивания смеси в голубой цвет), которая играет
роль акцептора водорода. Содержимое пробирок перемешивают, и
пробирки одновременно помещают в термостат при температуре 37°С.
Через 20–25 мин наблюдают обесцвечивание метиленовой сини в первой пробирке и отсутствие обесцвечивания в двух других.
СДН2 + метиленовая синь → СД + метиленовая синь-Н2
Первую пробирку сильно взбалтывают, после обесцвечивания
появляется вновь синее окрашивание, вследствие окисления лейкооснования метиленовой сини кислородом воздуха.
Метиленовая синь-Н2 + О2 → Метиленовая синь + Н2О2
19
4. Исследование дегидрогеназ цитратного цикла
Непосредственному дегидрированию в организме под влиянием
дегидрогеназ подвергаются многие субстраты. Наиболее важными
среди них являются изолимонная, α-кетоглутаровая, янтарная (сукцинат), яблочная кислоты, участвующие в цитратном цикле (цикле трикарбоновых кислот или цикле Кребса). Отщепленный от субстратов
водород (протоны и электроны) передается при помощи комплекса
ферментов тканевого дыхания в конечном итоге на кислород. Изолимонная кислота окисляется при дегидрировании и декарбоксилировании в α-кетоглутаровую кислоту, а янтарная – в фумаровую.
Материалы исследования и реактивы: мышечная кашица,
цитрат натрия, сукцинат натрия, сульфосалициловая кислота, раствор метиленовой сини, вазелинового масла.
Приборы и посуда: термостат или водяная баня.
Ход работы
В три пронумерованные пробирки вносят шпателем равные количества мышечной кашицы 0,2 г.
В первую пробирку добавляют 10 капель раствора цитрата
натрия, во вторую – сукцината натрия, а в третью (контрольную) –
10 капель раствора сульфосалициловой кислоты. Если между кусочками мышцы остались пузырьки воздуха, их удаляют стеклянной палочкой.
В каждую пробирку добавляют по капле раствора метиленовой
сини и по 10 капель вазелинового масла. Вазелиновое масло покрывает поверхность раствора, благодаря чему создаются анаэробные
условия и тем самым предотвращается окисление восстановленных
соединений кислородом воздуха.
Пробирку помещают в термостат или водяную баню при 37°С.
Отмечают постепенное обесцвечивание метиленовой сини в пробирках с раствором цитрата и сукцината. В контрольной пробе метиленовая синь не обесцвечивается, т.к. фермент был инактивирован сульфосалициловой кислотой.
5. Открытие альдегидоксидазы молока
Альдегидоксидаза относится к классу оксидоредуктаз. Окисляемыми субстратами, на которые действуют оксидоредуктазы, могут
быть спиртовая группа (-ОН), альдегидная (-СНО), кетонная (-СО),
этильная (-СН2-СН2-) и др., а также восстановленные формы пири-
20
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]