Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Медицинская энзимология. Лабораторный практикум
.pdf
Приборы и посуда: колбы плоскодонные; пищевой гомогени-
Эмульгатор и его
концентрация
Активность липазы
ЛС (ед/г)
Время расслаивания
эмульсии, мин
затор; пипетки на 1; 5; 10 мл; мерные цилиндры; бюретка; баня со
льдом; термостат.
Ход работы
1. Приготовление эмульсий:
В качестве эмульгаторов используют: 0,25% раствор твина 20;
2% раствор яичного альбумина; 3% раствор желатина; 2% раствор
поливинилового спирта (в качестве контроля).
Для приготовления субстрата 100 мл оливкового масла смешивают со 150 мл раствора соответствующего эмульгатора в пищевом
гомогенизаторе в течение 5-10 мин. Полученные эмульсии выдерживают на льду в течение 60 мин. Если расслаивание не наблюдается, субстрат пригоден к использованию. Если замечено расслаивание, перемешивание необходимо повторить.
Затем из полученных эмульсий отбирают по 10 мл и используют, отобранный субстрат для определения активности липазы по
модифицированному методу Ота-Ямада.
Оставшуюся часть эмульсий используют для определения устойчивости эмульсий. Для этого 50 мл соответствующей эмульсии помещают в мерный цилиндр и оставляют на льду в течение еще 60 мин.
Отмечают время начала расслаивания каждой эмульсии.
Делают выводы об устойчивости полученных эмульсий.
Задание:
1. Приготовить эмульсии оливкового масла с использованием
различных эмульгаторов
2. Провести процесс гидролиза оливкового масла панкреатиче-
ской липазой
3. Определить при использовании какого эмульгатора скорость
гидролиза максимальна, и сделать выводы .
4. Определить, как зависит активность липазы от устойчивости
эмульсии, и сделать выводы.
Данные занести в таблицу 3.
Таблица 3
Определение активности липазы
41
Контрольные вопросы
1. К какому классу ферментов относится липаза.
2. Какие реакции катализирует этот фермент? Напишите урав-
нения реакций.
3. Каким образом можно обнаружить липазу?
4 Чем грозит высокий уровень липазы?
5. Класиификация липазы по происхождению.
Рекомендуемая литература
Основная: 1, 2
Дополнительная: 2-10
Интернет-ресурсы: 1-9
8. Иследование амилаз
Цель занятия: изучить типы амилаз и исследовать их в различных объектах.
Формируемые компетенции: ОК-1, ОПК-5, ОПК-6, ОПК-7.
Теоретическая часть
Амилаза (КФ 3.2.1.1.) является ферментом, который катализирует гидролиз α-глюкозидной связи α-1,4-крахмала и гликогена до
промежуточных продуктов – декстринов. Крахмал обладает способностью образовывать с йодом соединение синего цвета, амилодекстрин – фиолетового, эритродекстрин – красно-бурого, ахродекстрин – желтого.
Амилаза – это первый энзим, обнаруженный учеными. В 1833
году этот фермент был описан французским ученым Пайя, который
обнаружил его в связи с разрушением крахмала в пищеварительном
тракте.
Фермент этот бывает трех типов: α, β, а также . Присутствует
не только в организме людей, но и животных, и даже у ряда растений (только β-амилаза, которая не присутствует в организме животных). Спелые фрукты обладают приятным сладким вкусом часто
благодаря наличию этого фермента. В пшенице присутствует
-амилаза, которая является главным веществом для производства
солода.
42
1. Выделение амилаз из солода
20 г измельченного солода растирают в ступке с небольшим
количеством воды до однородной массы и количественно переносят
в мерную колбу вместимостью 100 мл, объем доводят водой до
метки, содержимое перемешивают и оставляют на льду на 2 ч
(можно поставить в холодильник на ночь). По истечении времени
экстрагирования содержимое перемешивают и центрифугируют в
течение 10 мин со скоростью 3000 об/мин. (готовит лаборант). Центрифугат используют в качестве источника амилазы.
Материалы исследования и реактивы: солодовая вытяжка,
порошок (CH3COO)2Ca, Na2HPO4.
Приборы и посуда: шпатель, водяная баня, колба.
Ход работы
1.1 Выделение α-амилазы
В пробирку вносят 5 мл солодовой вытяжки, содержащей
активные α- и β-амилазы, добавляют на кончике шпателя порошок
(CH3COO)2Ca, и выдерживают в течении 15 мин на водяной бане,
нагретой до 68С (в период нагревания температура воды не должна
подниматься выше 70С и опускаться ниже 66°С). Затем
содержимое пробирки охлаждают холодной водой. При таком
прогревании β-амилаза полностью инактивируется, а α-амилаза
сохраняет свою активность. Полученный раствор используют для
определения активности α-амилазы.
1.2 Выделение β-амилазы
В колбу вместимостью 50 мл вносят 5 мл солодовой вытяжки,
содержащей активные α- и β-амилазы, добавляют 4 мл воды, 1 мл
0,1 М раствора HCl (рН полученной смеси должен быть 3,3). Затем
колбу с содержимым помещают на 15 мин на лед. В этих условиях
α-амилаза полностью инактивируется, а β-амилаза сохраняет свою
активность. Затем к содержимому колбы добавляют 2 мл 0,15 М
раствора Na2HPO4. рН должно быть 6,0. Полученный раствор
используют для определения активности β-амилазы.
2. Определение активности амилаз солода
Действие амилаз на крахмал можно установить либо по убыли
крахмала, либо по накоплению продуктов его распада – сахара.
Метод определения активности амилаз по массе
расщепленного крахмала получил название колориметрического.
Принцип метода состоит в том, что активность амилаз
43
рассчитывают по разности между массами взятого для опыта и
№
Компоненты, мл
Пробирки
1 2 3 4 5 6 1.
Вытяжка из солода
-
0,1
0,2 - - - 2.
α-Амилаза
- - -
0,2
0,4 - 3.
β-Амилаза
- - - - -
1,0
4.
Вода
1,0
0,9
0,8
0,8
0,6 - 5.
Буфер, рН 5,5
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
6.
Крахмал, 2%
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0 Разбавление, R
-
10 5 5
2,5
2,4
оставшегося по окончании опыта нерасщепленным крахмала,
определяемого фотометрическим анализом по цветной реакции с
йодом. При проведении опыта продолжительность инкубации и
объем раствора ферментного препарата устанавливают такими,
чтобы в опытных пробирках (содержащих фермент) не произошел
полный гидролиз крахмала. Данный метод позволяет установить
специфичность и активность совместного действия амилаз на
крахмал. α-Амилаза гидролизует в крахмале и родственных
полисахаридах α-1,4-гликозидные связи без определенного порядка.
В результате образуются декстрины и незначительное количество
мальтозы. β-Амилаза гидролизует в крахмале и родственных
полисахаридах α-1,4-гликозидные связи, последовательно отщепляя
молекулы мальтозы с нередуцирующих концов цепочек. Наиболее
эффективно гидролиз осуществляется под действием комплекса
амилаз, содержащихся в вытяжке из солода.
Материалы исследования и реактивы: Вытяжка из солода,
α-Амилаза, β-Амилаза, Вода, Буфер, рН 5,5, Крахмал, 2%, 1 М раствора HCl раствор Люголя.
Приборы и посуда: пробирки, штатив, термостат, ФЭК.
Ход работы
Для проведения опыта берут 6 пробирок, одна из них
контрольная. Пробирки заполняют в соответствии с таблицой.
Таблица
Определение активности амилаз солода
Ацетатный буфер pH 5,5 (к 57,4 мл 1 М раствора CH3COOH
добавляют 50 мл 1 М раствора NaOH, и общий объем доводят водой
до 500 мл).
44
Содержимое в пробирках перемешивают и ставят в термостат
,С
Е
EE
m
к
ок
при 37-38С на 30 мин. Такая постановка опыта позволяет
одновременно определить суммарную активность амилаз в
солодовой вытяжке, активность α-амилазы и активность β-амилазы.
По окончании времени инкубации пробирки из термостата
вынимают и в каждую немедленно добавляют по 2 мл 1 М раствора
HCl и по 3 капли раствора Люголя; содержимое перемешать.
Пробирки с содержимым, окрашенным в желтый цвет, убирают.
Пробирки с содержимым, окрашенным в синий, фиолетовый или
красный цвет оставляют для дальнейшей работы (если после
добавления раствора йода все пробирки с одним и тем же ферментным
препаратом будут окрашены в желтый цвет, то опыт следует
повторить, взяв этот ферментный препарат в меньшем количестве).
Берут мерные колбы вместимостью 50 мл, нумеруют их
соответственно номерам, оставленных для дальнейшей работы
пробирок. В каждую колбу вносят 30-40 мл воды, 0,5 мл 1 М
раствора HCl, 10 капель раствора Люголя и 0,5 мл смеси из
пробирки в соответствии с номером колбы. Непосредственно перед
отбором смеси содержимое пробирки перемешивают. Содержимое
колбы доводят до метки водой, перемешивают и колориметрируют
на ФЭКе при красном светофильтре против воды.
Активность амилаз выражают в мг расщепленного крахмала на
1 г солода за 1 мин. Расчет производят следующим образом:
где m – масса расщепленного крахмала за время опыта, мг;
Ек – оптическая плотность контрольного раствора;
Ео – оптическая плотность опытного раствора;
С – масса внесенного крахмала, мг (3 мл 2% раствора крахмала
содержат 60 мг крахмала).
Полученный результат умножают на разбавление, т.е. приводят
к 1 мл исходной ферментной вытяжки и затем делят на время
инкубации (30 мин), что позволяет выразить активность амилазы в
мг расщепленного крахмала 1 мл ферментной вытяжки за 1 мин.
Зная методику приготовления вытяжки из биологического
объекта, можно легко рассчитать активность амилазы в мг
расщепленного крахмала на 1 г биологического материала за 1 мин
по формуле:
45
,
30
60)(
1
mVЕ
VЕЕ
А
к
ок
где Ек – оптическая плотность контрольного раствора;
Ео – оптическая плотность опытного раствора;
60 – масса взятого для анализа крахмала, мг (в 3 мл 2%
раствора содержится 60 мг крахмала);
V – общий объем солодовой вытяжки, полученной из солода
(100 мл);
V1 – объем ферментного препарата, взятого для
инкубирования, мл;
30 – время инкубации, мин;
m – масса солода, взятого для приготовления солодовой
вытяжки, г.
При расчете активности β-амилазы в числитель необходимо
ввести число 2,4, которое учитывает все разведения солодовой
вытяжки, сделанные при выделении β-амилазы.
Результаты исследований записывают и делают выводы об
активности амилаз солода.
3. Открытие амилаз из плесневых грибов
(по Фениксовой)
В препаратах грибных амилаз содержится в основном α-
амилаза.
Материалы исследования и реактивы: плесневые грибы, во-
да, 1% раствора крахмала, раствора Люголя.
Приборы и посуда: пробирки, стеклянная палочка, термостат.
Ход работы
2 г сухих плесневых грибов смешивают с 50 мл воды, нагретой
до 37С, встряхивают 5 мин, а затем настаивают 2 ч при комнатной
температуре. После повторного встряхивания твердый остаток
отфильтровывают. В фильтрате содержится комплекс грибных
амилаз. В пробирку наливают 5 мл полученного фильтрата,
прибавляют 10 мл 1% раствора крахмала, быстро перемешивают и
тотчас 1 каплю содержимого пробирки смешивают на стеклянной
пластинке с 1-2 каплями раствора Люголя. Пробирки помещают в
термостат при 37С. Через каждые 2 мин повторяют пробу с йодом.
Отметить время образования промежуточных продуктов и
конечный распад крахмала.
46
4. Открытие амилазы в меде
Материалы исследования и реактивы: слюна, крахмальный
клейстер, иодная настойка, пчелиный мед, пищевая сода, уксус, сода, йод.
Приборы и посуда: штатив, пробирки.
Ход работы
Приготовьте пять растворов. Первый раствор: соберите в пробирку около 0,5 мл слюны и разбавьте холодной кипяченой водой в
двадцать раз. Второй раствор: очень жидкий крахмальный клейстер
(четверть чайной ложки крахмала на стакан воды). Третий раствор:
разбавленная водой в двадцать раз аптечная иодная настойка. Четвертый раствор: две-три капли пчелиного меда, разведенные водой
в десять раз и тщательно перемешанные. Пятый раствор: половина
чайной ложки пищевой соды на десять ложек воды.
Потребуется девять пробирок. Во все пробирки налейте около
5 мл клейстера. В пробирки 1, 4 и 7 прибавьте пипеткой по 5 капель
уксуса, а в пробирки 2, 5 и 8 – столько же раствора соды. В остальные пробирки прибавьте по 5 капель чистой воды. Содержимое всех
пробирок перемешайте и в каждую внесите по 10 капель разбавленной слюны.
Через 10 мин в пробирки 1, 2 и 3 прибавьте 1-2 капли раствора
иода и перемешайте смесь. Наблюдайте за изменением окраски.
Еще через 15 мин прибавьте такую же порцию иода в пробирки 4, 5
и 6, а еще через 10 мин – в остальные пробирки.
Крахмал и декстрины, как вы помните, дают различную окраску с подом, и по мере разрушения крахмала амилазой цвет меняется. Так можно судить не только о распаде крахмала, но и о том, какая среда – кислая, нейтральная или щелочная – более благоприятна
для этого процесса.
Активность амилаз в разных образцах может сильно колебаться, поэтому, возможно, время гидролиза придется уменьшить или
увеличить. Например, в слюне заядлых курильщиков амилазы содержится очень мало.
Контрольные вопросы
1. Какие ферменты мочи вы знаете?
2. Приведите примеры способов определения ферментов мочи.
3. Приведите примеры использование ферментов мочи в кли-
нико-диагностических лабораториях.
47
4. Приведите примеры использование ферментов в качестве
аналитических реактивов.
5. Техника выделения α-амилазы. На чем она основана?
6. Метод выделения β-амилазы, на чем он основан?
7. Специфичность действия и активность α-амилазы и
β-амилазы.
8. Принцип количественного определения активности амилаз?
Рекомендуемая литература
Основная: 1, 2
Дополнительная: 2-10
Интернет-ресурсы: 1-9
48
ТЕМА 4. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
9. Ферментативный катализ в неводных средах
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Изучит процесс гидролиза оливкового масла
панкреатической липазой включенной в обращенные мицеллы
ПАВ. Осуществить синтез воскоподобных соединений с помощью
панкреактической липазы.
Формируемые компетенции: ОК-1, ОПК-5, ОПК-6, ОПК-7.
Теоретическая часть
Ферменты являются лучшими на сегодняшний день катализаторами. Их исключительно высокая каталитическая активность и
непревзойденная субстратная специфичность открывают широкие
перспективы для использования биокатализа в технологических процессах. Особенно перспективным представляется применение ферментов, как катализаторов, в тонком органическом синтезе – при получении лекарственных веществ, поверхностно-активных соединений, ароматических веществ и др. Однако широкому использованию
ферментов на практике мешает то, что, они приспособлены природой
для функционирования, прежде всего в водных растворах.
В то же время известно, что многие химические реакции термодинамически направлены в сторону желаемого продукта лишь в
определенных органических растворителях.
Это связано, как со специфическими сольватационными эффектами, так и с растворимостью отдельных компонентов реакции.
Или с тем, что наряду с нужными продуктами в таких, например,
процессах, как полимеризация сахаров, нуклеотидов, аминокислот,
реакции дегидратации, этерификации и др., образуется вода и, следовательно, при проведении реакции в водных растворах равновесие сильно сдвинуто в сторону исходных веществ. Вследствие этого
в последние годы сильно возрос интерес к проблемам биокатализа в
неводных средах.
1. Гидролиз оливкового масла панкреатической липазой,
включенной в обращенные мицеллы
Многие ферменты сохраняют ферментативную активность при
включении их в обращенные мицеллы поверхностно-активных веществ в органических растворителях. Наличие в системе органиче-
49
ской фазы дает уникальную возможность изучать взаимодействие
ферментов с соединениями, которые растворяются только в органической среде (субстратами, кофакторами, модификаторами ферментативной активности и другими).
Используя обращенные мицеллы с органической фазой, в которой растворен субстрат, исследователь получает возможность избежать стадии эмульгирования субстрата, применяемой при работе
с липолитическими ферментами в водной среде. В результате становится возможным более строго подойти к анализу субстратной
специфичности фермента и оценке кинетических параметров.
Материалы исследования и реактивы: Раствор детергента,
1% панкреатическая липаза, оливковое масло; 0,02н. раствор NaOH
в 80 % этиловом спирте; 1% раствор фенолфталеина в 80% этиловом спирте.
Посуда и приборы: Пробирки с завинчивающимися крышками
или бюксы с притертыми крышками; пипетки объемом 1, 2, 5 мл;
мерные цилиндры; бюретка для титрования; термостат на 25С;
термометр.
Ход работы
Для приготовления раствора субстрата готовят 0,1 М/л раствор
оливкового масла, используя в качестве растворителя гексан или
петролейный эфир (возможно также использование в качестве растворителя пентана, гептана или октана), который содержит ПАВ в
концентрации 0,05 М. В качестве ПАВа используют: АОТ, Твин-20,
Бридж, Тритон-100.
Для включения фермента в обращенные мицеллы в ряд пробирок помещают по 1 мл раствора субстрата, в каждую добавляют
по 10 мкл 1 % раствора фермента в трис-HCl-буфере (рН=8,0, концентрация буфера 0,1 М). Смесь интенсивно встряхивают и выдерживают в течение 60 мин при температуре 37С. Отбор проб
осуществляют каждые 15 мин. Для этого часть пробирок вынимают из термостата и охлаждают до температуры 20С, содержимое
пробирок тщательно перемешивают и определяют количество выделившейся кислоты титриметрическим методом. Образовавшуюся в ходе реакции олеиновую кислоту оттитровывают спиртовым
раствором NaOH (0,02н раствор в 80 % этиловом спирте) с фенолфталеином до устойчивой (не исчезающей в течение 1 мин) розовой окраски.
50
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]