Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Медицинская энзимология. Лабораторный практикум
.pdf
диновых коферментов – никотинамид-адениндинуклеотида (НАД) и
никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ) и др.
Материалы исследования и реактивы: молоко, 0,4% формали-
на, вода, 0,01% раствора метиленового синего, вазелинового масла.
Приборы и посуда: водяная баня, пробирки, штатив, термостат.
Ход работы
В три пробирки наливают по 5мл свежего молока. Одну пробирку кипятят в течение 2-3 мин и остужают (1 пробирка).
В первую и вторую пробирки наливают по 1 мл 0,4% раствора формалина, а в третью – 1 мл воды. Во все три пробирки приливают по
1 мл 0,01% раствора метиленового синего.
Содержимое пробирок хорошо перемешивают и заливают в каждую по 3-4 капли вазелинового масла для предохранения жидкости от
соприкосновения с кислородом воздуха. Пробирки помещают в водяную баню при температуре до 40С. Через 15-30 мин в одной из них
происходит обесцвечивание жидкости. В какой и почему? Почему не
происходит обесцвечивание в двух других? Сделайте вывод.
Контрольные вопросы
1. Сохраняет ли фермент свою активность в кипяченом молоке?
2. При какой температуре раствор обесцвечивается быстрее?
3. Что произойдет, если продуть через обесцвеченный раствор
воздух?
4. Восстанавливается ли краситель в присутствии прокипяченной
кашицы из мяса? Нужна ли для этой реакции янтарная кислота?
5. Сходно ли поведение ферментов из тканей при высокой
температуре?
6. Приведите примеры реакций, катализируемых дегидро-
геназами.
7. Назовите ферменты, катализирующие окисление этилового
спирта, пировиноградной, яблочной, янтарной, щавелево-уксусной
кислот.
8. Расскройте механизм действия дегидрогеназ.
Рекомендуемая литература
Основная: 1, 2
Дополнительная: 2-10
Интернет-ресурсы: 1-9
21
4. Исследование пероксидазы
H2N NH
2
+ H2O
2
пероксидаза
NH NH
HO
OH
OH
2
+ 3H2O
2
пероксидаза
HO
HO
HO
O
OH
+ 5H2O + CO
2
Цель занятия: выделить и изучить фермент пероксидазу.
Формируемые компетенции: ОК-1, ОПК-5, ОПК-6, ОПК-7.
Теоретическая часть
Пероксидаза активирует перекиси, в том числе и перекись водорода. Под действием перекиси происходит окисление различных
фенолов и ароматических аминов. Этот фермент очень широко распространен в тканях растительного и животного происхождения. По
химической природе пероксидаза – геминовый фермент. Она содержит одну гематиновую группу. Пероксидаза способна катализировать окисление бензидина с образованием окрашенного соединения парахинондиимида.
бензидин п-хинондиимид
Пирогаллол окисляется при участии пероксидазы с образованием пурпургаллина красного цвета.
пирогаллол пурпургаллин
Материалы исследования и реактивы: редька, 2% раствор
пирогаллола, дистиллированная вода, 1% раствора H2O2, раствор
пирогаллола, неинактивированный препарат пероксидазы, воды.
Приборы и посуда: 2% раствора пирогаллола, штатив, пробирки.
А. В пробирку наливают 2 мл вытяжки из редьки, кипятят и
охлаждают (навеску в 1 г корня редьки измельчают, растирают в ступке и переносят в химический стакан, смывая водой, общий объем вытяжки не должен превышать 10 мл, вытяжку фильтруют через склад-
1. Выделение пероксидазы редьки
Ход работы
22
чатый фильтр). В 4 пронумерованные пробирки наливают по 1 мл 2%
раствора пирогаллола и добавляют: в 1 и 4 пробирки – 1 мл свежей
вытяжки из редьки, во 2 пробирку – 1 мл прокипяченной и охлажденной вытяжки, в 3 пробирку – 1 мл дистиллированной воды. Затем в
пробирки 1, 2, 3 добавляют 2-3 капли 1% раствора H2O2, взбалтывают
и наблюдают образование осадка (пурпургаллина).
Б. В пробирку налить 1 мл вытяжки редьки, прокипятить и
охладить. В 3 пробирки налить по 1 мл раствора пирогаллола.
В первую пробирку налить 1 мл неинактивированного препарата
пероксидазы, во вторую – 1 мл инактивированного препарата фермента, в третью – 1 мл воды. Затем во все пробирки добавить по
1 мл H2O2 и перемешать содержимое. Образуется осадок только
в первой пробирке. Сделайте выводы.
2. Выделение пероксидазы капусты
Материалы исследования и реактивы: капуста, гидрохинон,
пероксид водорода, яблоко, луковица.
Приборы и посуда: терка, марля или ткань, пробирки, водяная
баня, нож.
Ход работы
Кусочек капустной кочерыжки, примерно 20 г, измельчите на
терке, полученную кашицу отожмите через два слоя марли или
один слой ткани, сок соберите в стакан и разбавьте водой в десять
раз. Шесть чистых сухих пробирок или флакончиков пронумеруйте.
В пробирки № 1, 2, 3 и 4 налейте по 1 мл разбавленного капустного
сока. Пробирки 1 и 2 поставьте для инактивации ферментов минут
на пять в кипящую водяную баню, а затем охладите до комнатной
температуры. В пробирки 5 и 6 вместо сока налейте по 1 мл воды.
Во все шесть пробирок добавьте немного, на кончике ножа, гидрохинона. Затем в пробирки 1, 3 и 5 налейте по пять капель воды,
а в пробирки 2, 4 и 6 – по пять капель пероксида водорода. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешайте. Через десятьпятнадцать минут можно уже наблюдать результаты опыта.
Результаты нужно оформить в виде таблицы. Внесите в таблицу номера пробирок и состав смеси в каждой из них, в графе против
каждой смеси пометьте, изменилась ли окраска в ходе опыта, а если
изменилась, то как именно. В следующей графе сделайте вывод –
произошло ли окисление. Когда вся таблица будет заполнена, проанализируйте полученные результаты.
23
Поставьте такие же опыты мякотью яблок, с мясистыми чешуями луковицы. В этих случаях полученный сок надо разбавлять водой в 2-3 раза.
3. Открытие пероксидазы в молоке
Пероксидаза расщепляет пероксид водорода с выделением
кислорода, который окисляет йодистый калий. Реакция идет по
следующему уравнению:
Н2О2 + 2КI 2КОН + I2
Материалы исследования и реактивы: молоко, 1% раствора
крахмала, 10% раствора KI, 0,5% раствора H2O2.
Приборы и посуда: пробирки, штатив, водяная баня.
Ход работы
В две пробирки наливают по 5 мл молока. Молоко во второй
пробирке, служит контролем, ее нагревают до кипения. Затем в обе
пробирки добавляют по 1 мл 1 % раствора крахмала, по 2 капли
10 % раствора KI и по 5 капель 0,5 % раствора H2O2. В одной из
пробирок появляется синее окрашивание. В какой и почему?
4. Открытие пероксидазы в картофеле
Многократное дегидрирование (окисление) пирогаллола и ряда
промежуточных продуктов на пути к пурпурогаллину осуществляется с участием пероксидазы.
Материалы исследования и реактивы: 1 % раствора пиро-
галлола, 2 % раствора H2O2.
Приборы и посуда: пробирки.
Ход работы
Небольшое количество измельченного картофеля помещают в
пробирку, добавляют 1-2 мл 1% раствора пирогаллола и 1-2 капли
2% раствора H2O2. Через некоторое время выпадает желто-бурый
осадок пурпурогаллина.
Контрольные вопросы
1. К какому классу ферментов относится пероксидаза.
2. Какие реакции катализирует этот фермент? Напишите урав-
нения реакций.
3. Каким образом можно обнаружить перексидазу?
4. Может ли пероксид водорода окислить гидрохинон в отсут-
ствие капустного сока?
24
5. Окисляется ли гидрохинон под действием сока капусты без
пероксида водорода?
6. Сохраняется ли активность ферментов в соке после кипячения?
7. Какие окислительные ферменты содержатся в капустном со-
ке – оксидазы или пероксидазы?
8. Какая температура наиболее благоприятна для действия
пероксидаз?
Рекомендуемая литература
Основная: 1, 2
Дополнительная: 2-10
Интернет-ресурсы: 1-9
5. Исследование уреазы
Цель занятия: выделить и исследовать уреазу.
Формируемые компетенции: ОК-1, ОПК-5, ОПК-6, ОПК-7.
Теоретическая часть
Уреаза относится к классу гидролаз и отличается высокой специфичностью действия, субстратом для нее является мочевина.
Обнаружена во многих бактериях, грибах, растениях, а также у некоторых беспозвоночных. Уреаза – первый фермент, полученный в
кристаллическом виде (Дж. Самнер, 1926).
В качестве патогенного организма в желудке человека встречается бактерия Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori). Она также вы-
рабатывает уреазу. Бактерия Хеликобактер привлекла к себе внимание
тем, что местом ее обитания служит желудок, в котором теоретически
не может выживать ни один микроорганизм из-за высокой концентрации соляной кислоты. А эта бактерия не просто существует в таких
условиях, но и дезорганизует работу желудка. В 1994 г. Всемирная
организация здравоохранения занесла Хеликобактер пилори в разряд
канцерогенов первого класса. А как можно обнаружить эту бактерию?
Ученые разработали несколько методов обнаружения.
Экспресс-тест основан на определении активности фермента
уреазы в биоптате (материал, полученный путем биопсии). Биоп-
25
тат слизистой оболочки желудка сразу подвергается исследованию. Цветовая реакция, развивающаяся в геле через 1–2 или
30 мин., указывает на наличие или отсутствие уреазной активности в биоптате. Helicobacter pylori содержит большое количество
уреазы, которая гидролизует мочевину до аммония (NH
+
). Обра-
4
зование иона аммония регистрируется изменением цвета индикатора, присутствующего в геле.
На Западе стали использовать другой прием для определения
наличия в желудке человека болезнетворной бактерии – уреазный
дыхательный тест. Суть его в следующем. При наличии бактерии
Хеликобактер пилори в желудке синтезируется фермент уреаза, который отсутствует у здорового человека. Пациенту дают выпить
слабый раствор мочевины, обогащенной природным нерадиоактивным нуклидом углерода C13. В присутствии бактерии мочевина под
действием уреазы разлагается на углекислый газ и аммиак. Аммиак
реагирует с кислотой желудочного сока, а углекислый газ попадает
в кровь и выводится из организма через легкие. При этом в выдыхаемом пациентом воздухе увеличивается содержание C13. При отсутствии бактерии мочевина не разлагается, и никаких изменений в
составе выдыхаемого воздуха не происходит.
1. Выделение уреазы
Материалы исследования и реактивы: соевая мука, вода,
0,1н HCl.
Приборы и посуда: центрифуга.
Ход работы
Уреаза содержится во многих растениях, например, ее можно
обнаружить в соевой муке.
4-5 г соевой муки тщательно растирают в фарфоровой ступке в
смеси из 48 мл воды и 2 мл 0,1н HCl и нескольких капель толуола.
Смесь взбалтывают 1 час, а затем центрифугируют 15 мин при 5000
об/мин. Полученный прозрачный раствор используют в качестве
препарата уреазы для дальнейших опытов.
2. Определение активности уреазы
Предлагаемый метод основан на учете образующегося в процессе реакции аммиака при гидролизе мочевины NH2–CO–NH2. При
этом уреаза не действует на тиомочевину, структурно сходное вещество NH2–CS–NH2.
26
Препарат уреазы готовит лаборант: 8 г соевой муки или
,
t
525,14,1)(
ТВА
v
муки семян бобовых растений) заливают 46 мл дистиллированной воды, прибавляют 2 мл 0,1н. раствора НС1 и несколько к апель толуола, перемешивают и оставляют на ночь, затем фильтруют или центрифугируют, объем фильтрата доводят промывными водами до 50 мл.
Материалы исследования и реактивы: уреаза, 0,1 % раство-
ра HgCl2, 0,2 % метилового красного, 0,1 н. раствором НС1, азот.
Приборы и посуда: термостат, колбы.
Ход работы
В две колбы на 50 мл вносят по 5 мл препарата уреазы и по 5
мл 2% раствора мочевины в фосфатном буфере (рН 7), перемешивают. В одной из колб фермент инактивируют путем нагревания до
кипения; обе колбы ставят на 1 час в термостат при 37°С, после чего в колбы добавляют по 1 мл 0,1% раствора HgCl2, несколько капель 0,2 % метилового красного и выделившийся аммиак титруют
0,1 н. раствором НС1. 1 мл 0,1 н. раствора НС1 соответствует 1,4 мг
азота. Расчет активности уреазы производят по формуле:
где А и В – объем 0,1 н. раствора НС1, пошедшие на титрование
соответственно опытной пробы и контрольной, мл;
Т – поправка к титру раствора НС1;
t – время, в течение которого действовал фермент, мин;
1,25 – коэффициент для пересчета количества фермента на 1 г
навески муки.
За единицу активности уреазы принимают такое количество
фермента, которое за 5 мин при 37° С и рН 7 образует из мочевины
1 мг азота аммиака.
3. Установление термолабильности уреазы
Материалы исследования и реактивы: уреаза, мочевина, фе-
нолфталеин.
Приборы и посуда: баня водяная, термостат, 10% раствора
NaOH.
Для определения берут две пробирки, в обе наливают по 1 мл
вытяжки уреазы. Первую пробирку помещают на кипящую баню на
10 мин и охлаждают. Затем в обе пробирки добавляют по 1 мл раствора мочевины и по 1-3 капли фенолфталеина. Оставляют пробир-
27
ки при комнатной температуре на 5-10 мин. Записывают результат
Растительные
объекты
Соевые
бобы
Семена
дыни
Семена
огурцов
Семена
кабачков
Рисовая
мука
Наличие уреазы
и делают вывод.
Образование аммиака можно обнаружить и другим путем.
С этой целью повторяют опыт и после термостатирования при 37°С
в реакционную смесь осторожно добавляют равный объем 10% раствора NaOH. Выделение аммиака обнаруживают по запаху или по
посинению лакмусовой бумажки у отверстия пробирки.
4. Определение уреазы в растительных объектах
Фермент уреаза содержится в различных растительных объектах.
Материалы исследования и реактивы: вода дистиллированная, мочевина (1%-й раствор), фенолфталеин (0,1%-й спиртовой
раствор), соевые бобы, семена дыни, семена огурцов, семена кабачков, рисовая мука.
Приборы и посуда: Фарфоровая ступка и пестик, мерный цилиндр, пробирки.
Ход работы
1) Разотрите в ступке очищенные от кожуры семечки (бобы
или муку) с 5 мл воды до получения однородной суспензии.
2) Перелейте полученную суспензию в пробирку.
3) В пробирку налейте 5 мл раствора мочевины.
4) Добавьте 2–3 капли спиртового раствора фенолфталеина.
5) Содержимое пробирок перемешайте и оставьте при комнат-
ной температуре на 15–20 мин.
6) Отметьте происходящие изменения.
Занесите результаты эксперимента в таблицу.
Таблица
Определение уреазы в растительных объектах
ментов характерны специфические свойства, отличающие их от химических катализаторов. Одно из них – высокая специфичность
действия. Это означает, что фермент катализирует превращение
вещества мочевины в аммиак и углекислый газ и не действует на
другие вещества, даже очень схожего строения, например на тиомочевину. Формула последней очень похожа на формулу мочевины
Кроме общих свойств, присущих всем катализаторам, для фер-
28
и отличается от нее лишь тем, что вместо атома кислорода в молекуле имеется атом серы: H2N–CS–NH2.
5. Инактивация фермента уреазы
Многие вещества ингибируют действие фермента уреазы. Известно, что фенолы и их производные, спирты в высокой концентрации, формальдегид вызывают денатурацию белковой части фермента.
Определенные изменения происходят в ферментах и под действием
ионов. В некоторых напитках, например в чае, содержится вещество
эпигаллокатехин-3-галлат, которое ингибирует уреазу.
Материалы исследования и реактивы водная суспензия арбузных семечек, мочевина (1 % раствор), фенолфталеин (0,1 %
спиртовой раствор); испытуемые соединения: отвар зеленого чая,
0,01 M растворы фторида натрия, хлорида натрия, нитрата серебра,
сульфата никеля, ацетата свинца, раствор пероксида водорода
(1 объем 3% раствора разбавляют 10 объемами воды).
Приборы и посуда: Пробирки.
Ход работы
1) К суспензии арбузных семечек объемом 3 мл приливают
равный объем раствора испытуемого соединения (предполагаемого
ингибитора), тщательно перемешивают смесь; приливают 4 мл раствора мочевины и добавляют 1–2 капли раствора фенолфталеина.
2) Через 5 мин. наблюдают за изменением окраски раствора.
Если произошло изменение окраски в той или иной пробирке, то
считают, что данное вещество не является ингибитором фермента.
6. Определение мочевины в жевательных резинках
Материалы исследования и реактивы: арбузные семечки
(2–3 шт.), вода дистиллированная, пакетик с жевательной резинкой,
фенолфталеин (0,1% спиртовой раствор).
Приборы и посуда: Фарфоровая ступка и пестик, фарфоровая
чашка, мерный цилиндр, пробирка.
Ход работы
Разотрите в ступке очищенные от кожуры арбузные семечки с
5 мл воды до получения однородной суспензии. Перелейте полученную суспензию в пробирку. Приготовьте вытяжку из жевательной резинки. Для этого положите измельченную резинку в фарфоровую чашку, налейте 5–7 мл горячей дистиллированной воды. Для
лучшей экстракции перемешивайте содержимое. Охладите смесь до
комнатной температуры. Полученную вытяжку налейте в пробирку
29
с суспензией арбузных семян. Прилейте к содержимому пробирки
несколько капель раствора фенолфталеина и перемешайте. Отметьте происходящие изменения.
Контрольные вопросы
1. К какому классу ферментов относится уреаза.
2. Какие реакции катализирует этот фермент? Напишите уравнения реакций.
3. Каким образом можно обнаружить уреазу?
4. Абсолютная специфичность уреазы.
5. Что такое уреазный тест.
6. Методы обнаружения уреазы.
Рекомендуемая литература
Основная: 1, 2
Дополнительная: 2-10
Интернет-ресурсы: 1-9
6. Исследование каталазы
Цель занятия: Изучить активность каталазы.
Формируемые компетенции: ОК-1, ОПК-5, ОПК-6, ОПК-7.
Теоретическая часть
Каталаза – фермент, который разлагает образующуюся в про-
цессе биологического окисления перекись водорода на воду и молекулярный кислород, а также окисляет в присутствии перекиси водорода низкомолекулярные спирты и нитриты. Содержится почти
во всех организмах. Участвует в тканевом дыхании. Каталаза была
получена в кристаллическом состоянии. Её молекулярная масса
оценивается в 250 кДа. Относится к хромопротеидам, имеющим в
качестве простетической (небелковой) группы окисленный гем.
1. Открытие каталазы в биологических жидкостях
Каталаза катализирует разложение перекиси водорода на моле-
кулярный кислород и воду:
Н2О2 О2 + 2Н2О
По химической природе каталаза является геминферментом,
так как в состав простетической группы этого фермента входит. Ка-
30
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]