Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Аналитическая химия и физико-химические методы анализа. Лабораторный практикум
.pdf
Г л ав а 2
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Л а б о р а то р н а я р а бо та № 7
ОБНАРУЖЕНИЕ ВЕЩЕСТВ
МЕТОДОМ ХРОМАТОГРАФИИ
Р е а к т и вы и о бо ру д о в ан и е: бутиловый спирт (C4H5OH),
концентрированная соляная кислота (HCl), растворы диметилглиоксима, раданида аммония (NH4NCS), аммиака (NH4OH), ферроцианида калия (K4[Fe(CN)6]), хлороформ, сульфат натрия безводный свежепрокаленный (Na2SO4), уксусная кислота (СH3COOH),
красители (красный и синий), эксикатор, водяная баня, микрошприц, пинцет, шаблон, фотоэлектроколориметр, воронки,
стакан вместимостью 50 мл, фильтровальная бумага, камера хроматографическая, микропипетки, мерные цилиндры, водяная баня,
колбы конические вместимостью 50, 250 мл, камера с пришлифованной крышкой, кювета, цилиндры, стеклянные колпаки с притертым основанием, капилляры, пульверизаторы, линейка, бумага
для хроматографии, пробирки.
Т е о р е т ич е с к ое п о я с не ни е. Хроматографические методы занимают видное место в разделении, анализе и исследовании
свойств химических соединений. Эти методы отличают высокая
эффективность, простота эксперимента, селективность, экспрессность, возможность автоматизации в сочетании с другими физикохимическими методами. Особая их ценность заключается в том,
что с помощью хроматографии возможно разделение соединений с
близкими свойствами.
Хроматографический процесс заключается в перемещении
подвижной фазы (ПФ), содержащей компоненты разделяемой смеси, относительно неподвижной фазы (НФ). ПФ может быть жидкость (раствор анализируемой смеси веществ) или газ (смесь газов
или паров веществ); НФ – твердое вещество или жидкость, адсорбированная на твердом веществе, которая называется носителем.
При движении ПФ вдоль неподвижной компоненты смеси сорби-
71
руются на НФ. Каждый компонент сорбируется в соответствии со
,
L
1
Rf
сродством к материалу НФ, поэтому НФ называют сорбентом.
Захваченные сорбентом молекулы могут перейти в ПФ и продвигаться с ней дальше, затем снова могут сорбироваться. Так распределяются молекулы каждого компонента между двумя фазами.
Чем больше сродство компонента с НФ, тем сильнее он сорбируется и дальше задерживается на сорбенте, тем медленнее он продвигается с ПФ.
Компоненты смеси обладают разным сродством к сорбенту, поэтому при перемещении смеси вдоль сорбента произойдет разделение: одни компоненты задержатся в начале пути, другие продвинутся дальше и т. д. Так в хроматографическом процессе сочетаются термодинамический (установление равновесия между фазами) и кинетический (движение компонентов с разной скоростью)
аспекты.
Таким образом, сущность хроматографии состоит в том, что
разделяемые вещества перемещаются через слой НФ вместе с ПФ
с разной скоростью вследствие различной сорбируемости.
В распределительной хроматографии на бумаге разделение
веществ происходит вследствие различия в распределении между
двумя жидкими фазами, одна из которых (как правило, смесь органических растворителей) подвижна, а другая неподвижна и
представляет собой воду, находящуюся в волокнах хроматографической бумаги.
Основной характеристикой разделения веществ, показывающей
положение зоны вещества на полоске хроматографической бумаги,
является фактор Rf, определяемый как соотношение скорости (или
расстояния) движения фронтов пятна l и растворителя L:
где l – расстояние от линии старта до середины зоны; L – расстояние, пройденное растворителем от линии старта до линии фронта.
Разновидностью метода распределительной хроматографии выступает хроматография на бумаге. В этом случае адсорбентом
служит фильтровальная или специальная хроматографическая бу-
72
мага, неподвижной фазой является воздушно-сухая бумага, содер-
1 2 3
4
4
жащая около 25 % воды. В качестве подвижной фазы обычно применяют различные органические растворители и их смеси, менее
полярные, чем вода. Хроматографирование на бумаге проводят в
атмосфере насыщенных паров применяемых растворителей.
После достаточного продвижения фронта растворителя на бумаге процесс заканчивают и бумагу высушивают. При разделении
бесцветных веществ хроматограмму опрыскивают (проявляют) реактивом, образующим окрашенные соединения с анализиру-емыми
веществами. При этом на хроматограмме образуется ряд цветных
пятен, расположенных в определенном порядке (рис. 1, 2).
Рис. 1. Хроматографическая бумага, подготовленная к работе:
1 – хроматографическая бумага; 2 – проба;
3 – часть бумаги; 4 – чашка Петри
Рис. 2. Прибор для определения хроматографирования на бумаге
73
Для качественного анализа бумажных хроматограмм используют способ «свидетелей», нанося на одну и ту же полосу бумаги
пятно смеси и отдельно пятна набора веществ, присутствие которых в смеси требуется подтвердить. После проявления хроматограммы сопоставляют положение пятен «свидетелей» с положением пятен неизвестных веществ.
В колоночной хроматографии колонку наполняют носителем
(силикагелем, окисью алюминия, кизельгуром и др.) – веществом,
индифферентным к хроматографируемым веществам и к применяемому растворителю. Носитель удерживает на своей поверхности
жидкую фазу – неподвижный растворитель. Пробу хроматографируемого раствора, содержащего несколько компонентов, вносят в
колонку. После того как раствор впитается, колонку промывают
подвижным растворителем. При этом вещества смеси перераспределяются между двумя несмешивающимися жидкими фазами.
Ионообменная хроматография является разновидностью
жидкостной хроматографии. В ее основе лежит процесс обмена
между ионами анализируемого раствора и подвижными ионами
того же знака ионообменника.
В качестве ионообменников, или ионитов, обычно используют
синтетические полимерные вещества, называемые ионообменны-
ми смолами. Они состоят из матрицы и активных групп, содержащих подвижные ионы.
Ионообменную хроматографию применяют для разделения фенолов, карбоновых кислот, аминосахаров, пуриновых, пиримидиновых и других оснований. Часто иониты используют для предварительного разделения сложных смесей на менее сложные. На
ионном обмене основано получение ионитного молока для детского питания. Ионный обмен используют для очистки натуральных
соков от ионов тяжелых металлов. Ионообменные смолы применяют для получения ионообменных мембран.
Тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из
наиболее простых и эффективных экспресс-методов разделения и
анализа веществ в пищевых продуктах, биологических жидкостях
и других объектах, не требующих сложного оборудования.
74
В зависимости от природы неподвижной фазы тонкослойная
хроматография может быть адсорбционной и распределительной.
Наиболее широко применим в ТСХ первый вариант разделения.
Идентификацию веществ на хроматограмме осуществляют по
характеру окраски пятен, параметру удерживания Rf и с помощью
стандартных веществ («свидетелей»).
При стандартных условиях величина Rf является постоянной,
характерной для данного соединения. Наряду с величиной Rf идентификацию проводят по «свидетелю». Стандартное вещество
(«свидетель»), наличие которого предполагают в анализируемой
смеси, наносят на линию стандарта рядом с исследуемой пробой.
Тонкослойная хроматография применяется при исследовании
некоторых видов пищевых продуктов на безопасность, например
для определения токсинов (афлатоксинов, микотоксинов, патулина
и др.) в арахисе, зерновых, овощах, фруктах, напитках; для обнаружения пестицидов (ДДТ и др.) в растительных и животных продуктах, определения гистамина как показателя порчи рыбы.
В газовой хроматографии (ГХ) в качестве подвижной фазы
используют инертный газ (азот, гелий, водород), называемый газом-носителем. Пробу подают в виде паров, неподвижной фазой
служит или твердое вещество – сорбент (газоадсорбционная хроматография), или высококипящая жидкость, нанесенная тонким
слоем на твердый носитель (газожидкостная хроматография).
Газожидкостная хроматография широко применяется для
разделения, идентификации и количественного определения сложных многокомпонентных систем, таких как нефть, биологические
жидкости, пищевые продукты, парфюмерно-косметические изделия и многие другие. Метод отличается высокой чувствительностью, экспрессностью; для анализа не требуется большого количества исследуемого образца.
Среди разнообразных хроматографических методов газовая и
высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ) являются
самыми перспективными для решения сложных задач в практике
пищевого анализа.
Методами ГХ и ВЖХ идентифицируют и определяют летучие
вещества, участвующие в формировании вкуса и аромата многих
пищевых продуктов или отвечающих за их порчу. Например,
75
определяют летучие жирные кислоты, характерные для качественного мяса, или кислоты, образующиеся при изменении нормального процесса брожения квашеной капусты и обусловливающие посторонние оттенки ее запаха. Указанные методы используются для
определения никотина, нитрозоамина (в рыбе и копченостях), пищевых добавок (красителей, консервантов, антиокислителей), загрязнителей окружающей среды (пестицидов, афлатоксинов,
остатков лекарственных препаратов, витаминов) и др. Весьма ценными являются методы ГХ и ВЖХ в установлении фактов фальсификации потребительских товаров.
Опыт 1. Разделение аминокислот
Х о д р а бо ты
Для разделения аминокислот используют метод распределительной хроматографии на бумаге. Он основан на различной растворимости аминокислот в двух ограниченно смешивающихся
жидкостях: воде и смеси бутанола с уксусной кислотой. Вода, связанная с бумагой, является неподвижной фазой, органическая
смесь – подвижной. Чем больше растворимость аминокислоты в
воде, тем медленнее она двигается по бумаге, и наоборот – чем
выше ее растворимость в органической смеси, тем быстрее движется аминокислота, увлекаемая подвижной фазой.
Раствор исследуемой смеси веществ наносят в виде капли на
конец бумажной полоски. Бумагу высушивают. Конец ее ниже места нанесения капли опускают в сосуд с растворителем. При медленном продвижении растворителя через поры бумаги вместе с
ним перемещаются растворенные вещества, которые распределяются между двумя жидкими фазами – водой (неподвижной фазой,
связанной с бумагой) и органическим растворителем. Разделение
компонентов основано на различии их растворимости в водной и
органической фазах.
Коэффициент подвижности (Rf) служит константой для каж-
дой аминокислоты при данных условиях опыта (температура, сорт
бумаги и др.). Для проявления аминокислот после их разделения
бумаги обрабатывают раствором нингидрина, с которым аминокислоты образуют окрашенные комплексы.
Образование окрашенного вещества при взаимодействии α-аминокислот с нингидридом описывается уравнением
76
двойных связей окрашено в интенсивный сине-фиолетовый цвет.
H
O
OH
OH
C
R
O
O
O
O
H
OH
NH
3
CO
2
R
H2N−C−H
COOH
+
R
C−H
O
H
O
OH
OH
C
R
O
O
O
O
H
OH
NH
3
CO
2
O
O
OH H O
O
OH
OH
+
+NH3 + CO2.
края простым карандашом намечают стартовую линию. Пипеткой
осторожнo наносят анализируемую пробу. Диаметр пятна не должен превышать 5–6 мм. На расстоянии 1,5–2,0 см от анализируемой
пробы наносят пробы индивидуальных аминокислот («свидетели»).
Расстояние между ними должно быть не менее 1 см. После нанесения каждой пробы бумагу подсушивают. При использовании в качестве растворителя смеси бутанола-1, уксусной кислоты и воды
компоненты сначала смешивают в указанном соотношении непосредственно перед употреблением, а после расслаивания применяют
верхний слой жидкости. Верхний слой – н-бутанол, уксусная кислота, вода (47:13:40) наливают в качестве подвижной фазы в кювету и
помещают в камеру для хроматографирования. Полоску бумаги с
нанесенными на нее пробой и «свидетелями» помещают в кювету
таким образом, чтобы она была погружена в растворитель не более
чем на 5 мм. Растворитель не должен касаться стартовой линии. Для
насыщения камеры парами растворителя на задней стенке камеры
прикрепляется смоченный растворителем лист фильтровальной бумаги, доходящий до дна кюветы.
тограмму высушивают и затем для локализации анализируемых
аминокислот проявляют, опрыскивая из пульверизатора раствором
нингидрина в ацетоне. Аминокислоты обнаруживаются в виде синих пятен.
стью перемещения Rf.
анализируемой смеси строится калибровочная кривая зависимости
площади пятна (мм2) от количества аминокислоты (г), используе-
Образовавшееся соединение благодаря наличию сопряженных
На хроматографической бумаге на расстоянии 1,5 см от нижнего
Через 3 ч процесс хроматографирования заканчивают. Хрома-
Каждая аминокислота характеризуется относительной скоро-
Для количественного определения содержания аминокислот в
77
мой в качестве «свидетеля». Между количеством аминокислоты и
а
б
площадью пятна на пластинке должна существовать зависимость,
выражаемая прямой, выходящей из начала координат.
Опыт 2. Разделение смеси красителей
Х о д р а бо ты
Готовят 100 мл смеси н-бутанола, этанола и раствора аммиака в
соотношении 3:1:1 (по объему). Раствор наливают на дно широкого стакана. Из фильтровальной бумаги вырезают квадрат с длиной
стороны 20 см, кладут его на чистый лист писчей бумаги и проводят карандашом стартовую линию на расстоянии 3 см от края одной из сторон. Наносят вдоль линии 3 метки на расстоянии 3 см
друг от друга. Смешивают в любых соотношениях растворы красителей, например красные и синие чернила.
Рис. 3. Определение Rf компонентов на бумажной хроматограмме:
а – восходящая хроматография; б – радиальная хроматография
С помощью тонкого стеклянного капилляра наносят на отмеченные точки по капле чернильной смеси и отдельно по капле
красных и синих чернил. Высушивают бумагу, слабо сворачивают
ее в цилиндр и закрепляют верх и низ цилиндра скрепками для
бумаги. Бумажный цилиндр опускают метками вниз в сосуд с растворителем так, чтобы он не касался стенок. Уровень растворителя
должен быть на 1,5 см ниже уровня стартовой линии. Сосуд закрывают крышкой. Когда фронт растворителя поднимется на
10–12 см выше стартовой линии (около 1 ч), бумагу вынимают,
отмечают карандашом фронт растворителя и высушивают. Опре-
78
деляют Rf пятен для свидетелей и смеси (см. рис. 3). Сравнивают
коэффициенты их с Rf в смеси.
Опыт 3. Разделение на бумаге
смеси ионов Mn2+, Со2+, Ni2+.
Х о д р а бо ты
Бумага адсорбирует разделяемые ионы, вследствие чего хроматограммы часто получаются нечеткие, с размытыми краями. Для
подавления адсорбции анализируемых ионов к органическому
растворителю, например к бутиловому спирту, прибавляют соляную кислоту. Тогда бумага насыщается сильно адсорбирующимся
ионом водорода и адсорбция разделяемых катионов резко снижается. Оптимальное соотношение соляной кислоты и органического
растворителя можно выбрать, хроматографируя стандартные растворы известного состава.
Чтобы наблюдать зависимость коэффициента движения (Rf) от
количества добавленной кислоты, наливают в три цилиндра следующие смеси бутилового спирта и соляной кислоты: а) 4:1;
б) 4:1,7, в) 4:2,5. Наносят по капле разбавленного раствора, содержащего смесь катионов Mn2+, Со2+, Ni2+, на три полоски бумаги
для хроматографии длиной 30 см и шириной 3 см на расстоянии
1,5–2,0 см от одного из концов полоски. После подсушивания полученных пятен опускают каждую полоску в цилиндр пятном
вниз. Нижний конец полоски должен быть опущен в растворитель
так, чтобы пятно не касалось растворителя. Цилиндры ставят под
стеклянные колпаки и оставляют до тех пор, пока растворитель
не поднимется на 25 см. После высушивания фильтровальной бумаги и опрыскивания соответствующим проявителем измеряют
линейкой расстояние от центра первоначального пятна до центра
зоны каждого из ионов. Ионы никеля открывают, проявляя хроматограмму раствором диметилглиоксима, кобальта – раствором роданида аммония, марганца – раствором нитрата серебра, а затем
раствором аммиака. Полученные результаты записывают по следующей форме.
79
№
опыта
Состав по-
движного
раствори-
теля
Расстояние,
пройденное
растворите-
лем, см
Расстояние от нижнего края до центра зоны, см
катионы
Mn2+
Со2+
Ni2+
Опыт 4. Разделение железа и меди
с помощью хроматографии на бумаге
Х о д р а бо ты
Берут круглый обеззоленный фильтр – синюю ленту диаметром
12,5 см, простым карандашом чертят на нем «фитиль» длиной
40 мм и шириной 4 мм.
На центр фильтра наносят микропипеткой 0,05 мл раствора, содержащего катионы Fe3+ и Cu2+ (в количестве 20–50 мкг каждого).
Раствор не выливают на фильтр, а постепенно выпускают его из
пипетки, чтобы впитывание происходило за счет капиллярных сил
бумаги. Образовавшееся первоначальное пятно осторожно обводят
простым карандашом, т. е. фиксируют его положение на бумаге.
Дают фильтру высохнуть и вырезают бритвой фитиль.
Затем открывают эксикатор (т. е. хроматографическую камеру),
ставят в него кристаллизатор и тигель с 10 мл растворителя. Кладут фильтр сверху на кристаллизатор, следя при этом, чтобы «фитиль» был погружен в растворитель. В качестве растворителя используют смесь с массовыми долями этанола 90 % и 5 М НСl 10 %
(по объему); кислоту добавляют к органическому растворителю,
чтобы предотвратить адсорбцию ионов бумагой.
Закрывают эксикатор крышкой и оставляют на 3–4 ч для размывания первичной хроматограммы растворителем. После этого
берут фильтр из эксикатора, отмечают карандашом границы фронта растворителя и дают растворителю испариться.
Для проявления зон локализации ионов Fe3+ и Cu2+ опрыскивают фильтр раствором с массовой долей K4[Fe(CN)6] 10 % из стеклянного пульверизатора (металлический непригоден). В результате на хроматограмме проявляются синяя кольцевая зона
Fe4[Fe(CN)6]3 и коричневая кольцевая зона Cu 2[Fe(CN)6].
80
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]