Добавил:
Richie
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Лекции / Лекция 1
.pdf
В настоящее время метод секвенирования с
использованием радионуклидов не применяется.
Используется метод автоматического
секвенирования при помощи присоединенных к
каждому из ddNTP четырех разных флуоресцентных
маркеров (рисунок). Синтез ДНК проводят в одном
сосуде, после чего продукты флюоресцентной
реакции подвергают электрофорезу в тонком
стеклянном капилляре (капиллярный
электрофорез). Проходя через отверстие в
капилляре, флюоресцентные метки возбуждаются
лазерным лучом и начинают испускать свечение,
которое регистрируется цифровой камерой,
превращается в электрический сигнал и выводится в
виде графика.
Рестрикционный анализ
Рестриктазы – это ферменты бактерий, специфически
разрезающие ДНК бактериофагов в определенных сайтах. У
самих бактерий ДНК в сайтах рестрикции модифицирована
метилированием. Для обозначения рестриктаз используют
три первые буквы из названия вида бактерии (например,
BglII – из Bacillus globigi, EcoRI – из E. coli), после которых
курсивом следуют определенный буквенный символ,
обозначающий генетическую линию или штамм, и римская
цифра.
Известно три основных типа рестриктаз: I тип – узнают НП
и разрезают ДНК неподалеку от нее, но само место разреза
не строго специфично; II тип – узнают НП и разрезают ДНК
в определенной фиксированной точке внутри этой
последовательности; III тип – узнают НП и разрезают ДНК,
отступив определенное число нуклеотидных пар от ее
конца.
Для выявления специфических фрагментов ДНК
используется метод блот-гибридизации по Саузерну.
Эта методика состоит из следующих этапов:
1. После окончания электрофореза гели помещают в
щелочной раствор для денатурации фрагментов ДНК получают одноцепочечные ДНК.
2. Одноцепочечные ДНК вымывают из геля на
нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтры
перпендикулярным поверхности геля током буфера.
3. Одноцепочечные фрагменты ДНК фиксируют на
фильтре.
Блот-гибридизация по Саузерну
4. Для визуального выявления
нужных фрагментов проводят
гибридизацию исследуемого
образца со специфическим по
нуклеотидной последовательности
меченным радиоактивно или
флюоресцентной меткой
олигонуклеотидным
синтетическим зондом.
5. Радиоактивно меченные участки
выявляют путем экспонирования
фильтра с рентгеновской пленкой
(авторадиография).
6. Флюоресцентные метки
выявляют в люминесцентном
микроскопе.
Этот метод позволяет обнаружить
единственный ген среди десятков тысяч.
(из obi.img.ras.ru/humbio/har)
Биохимические методы
Наследственные заболевания, которые обусловлены генными мутациями, изменяющими
структуру или скорость синтеза белков, обычно сопровождаются нарушением углеводного,
белкового, липидного и других типов обмена веществ. Наследственные дефекты обмена можно
диагностировать посредством определения структуры измененного белка или его количества,
выявления дефектных ферментов или обнаружения промежуточных продуктов обмена веществ
во внеклеточных жидкостях организма (крови, моче, поте и т.д.)
Кроме выявления гомозиготных носителей мутантных генов существуют методы выявления
гетерозиготных носителей некоторых рецессивных генов, что особенно важно при медико-
генетическом консультировании.
Так, у фенотипически нормальных гетерозигот по фенилкетонурии после приема фенилаланина
обнаруживается повышенное его содержание в крови.
При гемофилии гетерозиготное носительство мутантного гена может быть установлено с
помощью определения активности фермента, измененного в результате мутации.
Соседние файлы в папке Лекции