Добавил:
Richie
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Лекции / Лекция 1
.pdf
Х-сцепленный доминантный тип наследования (синдром
Ретта, витамин D резистентный рахит)
• В браке больной женщины и здорового мужчины риск
развития болезни у ребенка = 50% не зависимо от пола
• В браке больного мужчины со здоровой женщиной риск
развития болезни у сыновей = 0%, у дочерей = 100%.
• Болезнь передается «по вертикали»
• Женщины болеют в 2 раза чаще
• При некоторых болезнях (синдром Ретта) болеют только
женщины, так как гемизиготность по мутантному аллелю
не совместима с жизнью
Y-сцепленные (нарушения сперматогенеза, рост
тела, конечностей, зубов, гипертрихоз ушных
раковин)
Митохондриальные болезни (атрофия зрительного
нерва Лебера, синдром Кернса-Сейра, синдромы
MELAS и MERRF)
• Болезнь передается только по материнской линии
• Болеют мальчики и девочки
• Больные мужчины не передают болезнь потомству
• Характерна гетероплазмия (не все митохондрии несут
мутации)
Цитогенетический метод
Используют для изучения нормального кариотипа
человека,
а также при диагностике наследственных
заболеваний, связанных с геномными и
хромосомными мутациями.
Кроме того, этот метод применяют при исследовании
мутагенного действия различных химических
веществ, пестицидов, инсектицидов,
лекарственных препаратов и др.
Этапы цитогенетического метода
Подробное описание цитогенетического метода
1) Для цитогенетического исследования достаточно 0,5 мл
венозной крови.
2) Для культивирования во флакон с культуральной средой (с
глутамином) и сывороткой крови (крупного рогатого скота)
добавляют 0,5 мл исследуемой крови + антибиотик (гентамицин)
+ фитогемагглютинин (стимулирует митоз). Перемешивают,
помещают в термостат на 72 часа (3 суток) при 37оС.
3) За 2 часа до фиксации добавляют колхицин. Непосредственно
перед фиксацией клетки обрабатывают 0,56% раствором KCl
при 37оС. Фиксацию производят смесью уксусной кислоты и
метанола (1:3) в течение 60 минут. Далее на предметное стекло
наносят 2 капли осадка, высушивают и окрашивают.
При дифференциальной G-окраске (по Гимзе) хромосомы
предварительно обрабатывают протеазой.
Состав красителя Гимза: Метанол – 750 мл, Глицерин – 256 мл,
Азур-1 – 3,772 г, Эозин – 2,165 г, Метиленовый синий – 1,563 г.
Готовый жидкий краситель перед окрашиванием разводят из
расчета 2 капли на 1 мл дистиллированной воды.
Методы дифференциального
окрашивания хромосом человека
В 70-е годы ХХ века были разработаны методы
дифференциального окрашивания хромосом человека, которые
показали, что каждая пара хромосом имеет свой специфический
характер чередования неокрашенных, светло- и темноокрашенных
дисков (Парижская классификация хромосом человека).
Разработка специальных методов окраски значительно упростила
распознавание всех хромосом человека, а в совокупности с
генеалогическим методом и методами клеточной и генной
инженерии дала возможность соотносить гены с конкретными
участками хромосом. Комплексное применение этих методов
лежит в основе составления карт хромосом человека.
Методы дифференциального окрашивания
хромосом человека
Схематическое
изображение
дифференциально
окрашенных
хромосом человека
согласно
международной
классификации
Молекулярно-цитогенетический метод
Основан на технологии флюоресцентной гибридизации in situ
(FISH).
FISH-метод в зависимости от фазы клеток:
1) На интерфазных клетках.
2) На метафазных клетках - можно определять локализацию
генов в хромосомах и все хромосомные аберрации (этапы
соответствуют цитогенетическому методу + обработка зондом и
гибридизация).
3) На клетках в стадию поздней профазы (вместо колхицина
используют метотрексат).
FISH-метод в зависимости от типа мечения зонда:
А – прямое мечение (непосредственно к зонду присоединяют
флюоресцентный краситель).
В – непрямое мечение (используется чаще, более чувствительная
методика).
НЕПРЯМОЙ МЕТОД:
Для исследуемой хромосомы или ее участка готовят однонитевой
участок ДНК (ЗОНД), к которому присоединяют биотин и
дигоксигенин.
На микроскопическом препарате in situ денатурируют
хромосомную ДНК щелочной обработкой, то есть разрывают
связи между двумя цепочками ДНК.
Препарат обрабатывают зондом. Так как последовательность
нуклеотидов зонда и соответствующего участка исследуемой
хромосомы комплементарны, то зонд присоединяется к хромосоме.
В этом участке происходит ренатурация ДНК.
Далее препарат обрабатывают стрептовидином (присоединяется к
биотину) или антидигоксигениновым антителом (к дигоксигенину).
К этим веществам присоединяют флюоресцентные красители
(родамин - красный цвет или флюоресцеин - зеленый цвет).
Молекулярно-цитогенетическая диагностика
Fluorescent in situ hybridisation (FISH)
➢Подготовка цитологического препарата
➢Выбор и подготовка ДНК-пробы
➢ Обработка препарата перед гибридизацией
➢Проведение гибридизации in situ
➢Постгибридизационная обработка препарата
➢Анализ результатов
➢Заключение по результатам исследования
Соседние файлы в папке Лекции