Добавил:
Richie
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Лекции / Лекция 1
.pdf
Молекулярно-цитогенетические методы
24-цветная FISH хромосом человека:
a - метафазная пластинка;
b - pаскладка хромосом.
(из Рубцов Н. Б., Карамышева Т. В. Вестн. ВОГиС, 2000).
WCP-4
46,XY,t(4;15)
FISH
с хромосом-специфическими
ДНК-пробами
на “прямых” препаратах из
хориона/плаценты
45,X
DXZ1
D18Z1
47,XX,+i(18p)
WCP-7
47,ХY,+mar
ЭТАПЫ FISH-МЕТОДА
1. Конструирование зондов (размер не более 1000
п.н.).
2. Приготовление препарата метафазных хромосом
(глава 1.4) или интерфазных ядер, фиксация на
предметном стекле.
3. Денатурация ДНК (воздействие формамда при
70оС).
4. Добавление ДНК-зонда и гибридазация в
течение 12 часов.
5. Отмывка, удаление негибридизировавших
зондов.
6. Визуализация люминесцентным микроскопом.
Молекулярно-генетические методы направлены на выявление
изменений или особенностей структуры исследуемого участка
ДНК вплоть до расшифровки первичной последовательности
оснований.
Все методы начинаются с выделения из образцов (чаще всего
крови) ДНК или РНК, которые в дальнейшем используют для
анализа.
В пробирку с предварительно добавленными цитратом натрия и
ЭДТА набирают 5 мл крови (соотношение консерванта и крови
1:4) и хорошо перемешивают.
Хранение при +40С не более двух недель.
Обязательные данные при сборе материала: ФИО, пол, дата
рождения, место жительства и место рождения, национальность.
Фенол-хлороформная экстракция ДНК из крови
Суть метода: выделить ДНК из клеток путем лизиса их оболочек, далее
осадить ДНК центрифугированием и очистить фенол-хлороформной
смесью.
Применение фенола и хлороформа при веделении ДНК способствует
созданию двухфазной системы. Фенол отделяет белки от ДНК.
Хлороформ денатурирует белок и липиды и помогает поддерживать
разделение органической и водной фазы, а также делает ДНК менее
растворимой в феноле.
ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ:
ПЕРВЫЙ ДЕНЬ:
1) К 5 мл крови добавляют 30 мл холодного лизирующего буфера
(таблица 6). Точно уравновешивают пробирки, стоящие в центрифуге
друг против друга!
Полученную смесь центрифугируют при +40С со скоростью 4000
оборотов/минуту в течение 20 минут.
2) Супернатант сливают, к осадку добавляют 20 мл холодного
лизирующего буфера, перемешивают и центрифугируют при 4000
об/мин, при +40С в течение 10 минут.
Центрифуга для 1-го этапа выделения ДНК
3) Надосадочную жидкость слить, ресуспензировать осадок в 800 мкл буфера
для протеиназы К (Soline ЭДТА).
4) Перенести осадок с Soline EDTA в эппендорф на 2 мл, добавить 80 мкл 10%
SDS (таблица 12) и 20 мкл протеиназы К (10мг/мл), слегка перемешать и
добавить Soline EDTA до 1 мл.
5) Готовую смесь хорошо перемешать на ротаторе (рисунок ), добавить Soline
EDTA до 1 мл и инкубировать в термостате при t=37
0
С 12 часов.
ВТОРОЙ ДЕНЬ:
1) В эппендорф с инкубированной смесью добавляют 800 мкл
забуференного фенола (на 50 мл фенола-Трис-НCl 200 мкл
меркаптоэтанола). Перемешивать на ротаторе в течение 10 минут
до однородной массы.
2) Центрифугировать при 5000 об/мин в течение 10 минут.
3) Супернатант перенести в новый эппендорф, добавить 500 мкл
забуференного фенола и 500 мкл хлороформ-изоамилового
спирта (24 мл хлороформа + 1 мл изоамилового спирта).
Перемешивать на шейкере в течение 10 минут до однородной
массы.
После центрифугирования раствор разделится на 2 слоя –
для следующего этапа осторожно берем верхний слой,
стараясь не захватить нижнего, иначе очистку придется
повторять!
4) Центрифугировать при 5000 об/мин в течение 10 минут.
5) Супернатант перенести в новый эппендорф, добавить 800 мкл
хлороформ-изоамилового спирта. Перемешивать в течение 5
минут на шейкере до однородной массы.
6) Центрифугировать при 3000 об/мин в течение 3 минут.
7) Супернатант перенести в новый эппендорф, добавить 1000 мкл
охлажденного (при -200С) 96% этанола (2 объема). Как можно
быстрее перемешать, наблюдая преципитацию ДНК. Если
супернатанта, содержащего ДНК, больше 500 мкл, то лучше
разлить по двум эппендорфам и также добавить охлажденный
96% этанол.
8) Центрифугировать при 10000 об/мин в течение 5 минут.
9) Осторожно слить спирт, промыть осадок 2 мл 70% этанола до
удаления солей, тщательно встряхивая пробирку.
10) Полностью слить спирт и высушить осадок при комнатной
температуре о полного испарения спирта.
11) Высушить ДНК при комнатной температуре и растворить в
дистиллированной воде.
СХЕМА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ФЕНОЛ-ХЛОРОФОРМНЫМ МЕТОДОМ
Соседние файлы в папке Лекции