Технология ПЦР-анализа. Учебное пособие

МИНИСТЕРСТВОНАУКИИВЫСШЕГООБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙФЕДЕРАЦИИ

БЮДЖЕТНОЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕУЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГООБРАЗОВАНИЯ «КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТим.Х.М.БЕРБЕКОВА»

ТЕХНОЛОГИЯ ПЦР-АНАЛИЗА Учебное пособие

Рекомендовано Редакционно-издательским советом КБГУ в качестве учебного пособия для обучающихся по направлению подготовки 06.03.01 Биология

Нальчик

КБГУ

2022

УДК 57 (075.8) ББК 28.070 я73 Т38

Рецензенты:

кафедра клеточной биологии, морфологии и микробиологии ФГБОУ ВО «Чеченский государственный университет»

доктор биологических наук, профессор кафедры клеточной биологии, морфологии и микробиологии ФГБОУ ВО «Чеченский государственный университет»

П.М. Джамбетова

Авторы: Боготова З.И., Хакунова А.А., Биттуева М.М.,

Паритов А.Ю., Гидова Э.М., Хандохов Т.Х.

Т38 Технология ПЦР-анализа : учебное пособие / З. И. Боготова, А. А. Хакунова, М. М. Биттуева, А. Ю. Паритов, Э. М. Гидова, Т. Х. Хандохов ; Министерство науки и высшего образования Российской Федерации, Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова. – Нальчик : Каб.-Балк. ун-т, 2022. – 74 с. : ил. – Библиогр. : с. 73. – 50 экз. – Текст : непосредственный.

Издание содержит основные современные молекулярно-генетические методы исследований, методики выделения нуклеиновых кислот из различного биологического материала, проведения полимеразной цепной реакции, детекцией фрагментов нуклеиновыхкислот в гелях.

Предназначено дляобучающихсяпо направлениюподготовки «Биология».

УДК 57 (075.8) ББК 28.070 я73

Боготова З.И., Хакунова А.А., Биттуева М.М., Паритов А.Ю., Гидова Э.М., Хандохов Т.Х., 2022

2

3

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГМО – генетически модифицированный организм дАТФ – дезоксиаденозинтрифосфат дГТФ – дезоксигуанозинтрифосфат ДДС – додецил сульфат натрия ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ – дезоксинуклеотидтрифосфат дТТФ – дезокситимидинтрифосфат дУТФ – дезоксиурацилтрифосфат дЦТФ – дезоксицитозинтрифосфат ДЭПК – диэтилпирокарбонат кДНК – комплементарная ДНК

ЛСН (SD(L)S – Лаурилсульфат натрия (sodiumdodecyl(lauryl)sulfate)

НК – нуклеиновая кислота ОЕ – оптическая единица

ОТ ПЦР – полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией п.н. – пара нуклеотидов

ПААГ (PAGE) – электрофорез в полиакриламидном геле ПСА (PSA) – перецилсульфата аммония

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ (real-time PCR) – полимеразная цепная реакция в режиме «реального времени»

РНК – рибонуклеиновая кислота т.п.н. – тысячи пар нуклеотидов ТAE – Трис-ацетатный буфер ТБЕ – Трис-боратный буфер ТЕМЕД – тетраметилэтилендиамин УГ – N-урацил-гликозилаза

ХЧ – химически чистый Ч. – чистый ч.д.а – чистый для анализа

Ct – пороговое число циклов (cyclethreshold) ddH20 – дважды дистиллированная вода NT – комнатная температура

4

ВВЕДЕНИЕ

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод моле-

кулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты в биологическом материале (пробе).

Открытию полимеразной цепной реакции предшествовало развитие моле- кулярно-биологических технологий. В 1983–1984 гг. К. Мюллис провел ряд экспериментов по разработке ПЦР. К. Мюллис вместе с Ф. Фалуном разработали алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР. Таким образом сформировался принцип использования ПЦР как метода амплификации in vitro заданных фрагментов ДНК с полностью или частично известной последовательностью.

Результатом открытия ПЦР стало почти немедленное практическое применение метода. Особенно бурное развитие метод ПЦР получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные технологии секвенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК). Это в свою очередь способствовало значительному росту информационных баз данных, содержащих последовательности ДНК биологических объектов. В настоящее время предложены различные модификации ПЦР, показана возможность создания тест-систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечныхмутаций,описаны десятки различных применений метода.

Таким образом, открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Этопозволилоподнятьмедицинскуюдиагностикунакачественноновыйуровень.

Наданный момент метод ПЦР широко используетсяв следующих отраслях:

1)медицина, система санитарно-эпидемиологического контроля:

• диагностика инфекций;

• диагностика иммунных патологий;

• генетические исследования наследственных заболеваний;

• определение ГМИ пищевых продуктов;

2)ветеринария и растениеводство:

•инфекционные заболевания;

•определение видовой принадлежности; 3) наука:

•генная инженерия, микробиология, генетика и др.; 4) промышленность:

•определение биологического загрязнения (санитарный контроль); 5) судебная медицина:

•идентификация личности.

5

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1 Устройство и оснащение пробоподготовочной зоны

Цель: ознакомление с лабораторным оборудованием для пре-ПЦР зоны и их назначением.

Материалы и оборудование: методические материалы; лаборатория МБЦ КБГУ.

Организация ПЦР-лаборатории регламентирована Методическими указаниями (МУ 1.3. 2569-09) «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности» [5]. Согласно данным МУ лаборатория в соответствии с этапами проведения анализа должна включать набор последовательно расположенных самостоятельных рабочих зон (помещений) или отдельно выделенных рабочих зон в составе других функциональных помещений.

В зоне первичной обработки биоматериала и выделения нуклеиновых кислот проводят сортировку, маркировку поступившего биоматериала, а также утилизацию остатков после выделения нуклеиновых кислот (НК). Подготовка, обработка биоматериала и выделение НК проводится в ламинарных системах (боксы абактериальной воздушной среды), обеспечивающих инфекционную безопасность. В ламинарных системах не допускается проведение других видов работ.

Зону выделения ДНК/РНК размещают в отдельном помещении. При организации ПЦР-лаборатории на базе действующей лаборатории допускается выделение ДНК/РНК в помещениях, в которых проводят другие виды исследований, кроме генно-инженерных работ. В этом случае в помещении организуют рабочую зону для выделения ДНК/РНК, в которой располагают ПЦР-бокс или бокс биологической безопасности. В ПЦР-боксе для выделения ДНК/РНК не допускается проведение других видов работ!

Лаборатория в соответствии с этапами проведения анализа должна включать следующий набор последовательно расположенных самостоятельных рабочих зон (помещений) или отдельно выделенных рабочих зон в составе других функциональных помещений, количество которых определяется используемыми методами амплификации нуклеиновых кислот (рис. 1):

приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала (Рабочая зона 1);

выделения нуклеиновых кислот (рабочая зона 2);

проведения реакции амплификации и учета ее результатов при использовании гибридизационно-флуоресцентного метода детекции (рабочая зона 3);

учета результатов реакции амплификации нуклеиновых кислот методом электрофореза и (или) гибридизационно-ферментным методом детекции (рабочая зона 4–1);

учета результатов (детекции) продуктов амплификации нуклеиновых кислот методом секвенирования и (или) на ДНК-чипах (рабочая зона 4–2).

6

Рис. 1. Рекомендуемые схемы размещения помещений лаборатории, использующей методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности:

1 – зона приема, разбора и первичной обработки материала; 2 – зона подготовки проб и выделения НК; 3 – зона приготовления реакционных смесей, проведения ОТ и ПЦР; 4 – зона детекции результатов методом электрофореза; 5 – комната анализа результатов; 6 – предбокс; 7 – комната обеззараживания материала

Все производственные комнаты должны быть снабжены коротковолновыми ультрафиолетовыми лампами. Перемещение пробирок и штативов должно производиться только в направлении из зоны подготовки реакционных смесей в зоны пробоподготовки и детекции. Все производственные комнаты должны быть снабжены необходимым оборудованием и расходными материалами, в том числе халатами и сменной обувью, закрепленными за соответствующими помещениями.

Таблица 1

Список рекомендуемого оборудования зоны выделения ДНК и РНК

7

8

Вопросы для самопроверки

1.На какие рабочие зоны разделяется лаборатория по анализу и амплификации нуклеиновых кислот?

2.Что проводят в зоне первичной обработки?

3.Какие приборы входят в состав пробоподготовочной зоны и каково их

функциональное назначение?

9

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2 Устройство и оснащение зоны приготовления

реакционных смесей и проведения ПЦР

Цель: ознакомление с лабораторным оборудованием зоны приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР и их назначением.

Материалы и оборудование: методические материалы; лаборатория МБЦ КБГУ.

Помещение для приготовления реакционных смесей и проведение ПЦР должно быть отдельным. В данной зоне производят приготовление ПЦР-смеси, внесение в пробирку для ПЦР выделенных образцов ДНК и кДНК, обратную транскрипцию РНК, амплификацию ДНК и кДНК. Приготовление всех реакционных смесей проводится в ПЦР-боксе. В данной зоне предусматривается защита от внутренней лабораторной контаминации – «чистая» зона.

Каждое помещение ПЦР-диагностической лаборатории должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящихся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате должны иметь соответствующую маркировку.

Следует однократно использовать перчатки, как в комнате обработки клинических образцов, так и в комнате приготовления реакционной смеси и постановки ПЦР. Необходимо однократно использовать пробирки и наконечники для автоматических пипеток. Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК или при раскапывании реакционной смеси. Необходимо использовать наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером (или наконечники с ватными фильтрами, приготовленными в помещении, в котором не ведутся работы с ДНК) при обработке клинических образцов, а также при внесении выделенной ДНК в реакционную пробирку.

Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо подвергать ультрафиолетовому облучению продолжительностью не менее 30 мин.

Таблица 2

Список рекомендуемого оборудования зоны приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР

10