Технология ПЦР-анализа. Учебное пособие

2. За 20–30 мин до приготовления рабочей амплификационной смеси извлечь комплект реагентов для ПЦР из морозильника, разморозить содержимое. Пробирки с реакционной смесью и полностью размороженным раствором разбавителя тщательно перемешать. Перемешивание разбавителя происходит при переворачивании пробирки (пузырём воздуха). Перемешивание реакционной смеси проводят вортексированием.

3.Изкомпонентовкомплектаприготовитьрабочиесмеси реагентов для амплификацииизрасчетана1пробу:

17,5мклразбавителя,

2,5мклреакционной смеси,

0,2 мкл Taq-полимеразы (вносится в последнюю очередь, перед внесением смесь рекомендуетсяперемешать).

Готовятся 2 рабочие смеси: с реакционной смесью аллель 1 и с реакционной смесьюаллель2.

При приготовлении рабочей амплификационной смеси необходимо все компоненты добавлять отдельными наконечниками с аэрозольными барьерами (фильтрами). Такие же наконечники необходимо использовать и для внесения в пробирки препарата ДНК.

4.После добавления Taq-полимеразы, которое производится в последнюю очередь,необходимотщательно перемешать смесь пипетированием.

5.Добавить по 20 мкл соответствующей рабочей амплификационной смеси вовсесоответствующиепробирки,подготовленныедляамплификации.

6.Добавить во все пробиркипо1 капле(около25 мкл) минерального масла.

7.Внести по 5 мкл образца из обработанной анализируемой пробы в пробирку с рабочей амплификационной смесью аллель 1 и в пробирку с рабочей амплификационной смесью аллель 2 под слой масла. В качестве отрицательного

контрольного образца вносится разбавитель в объеме 5 мкл в оба типа реакционной смеси.

8.Пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3–5 сек при 1500–3000 об/мин прикомнатнойтемпературенамикроцентрифуге-вортексе.

9.Перенести пробирки в прогретый до температуры +94 °С (установив-

шаяся температурав режимеПауза) программируемый термостат (амплификатор) ипровести амплификациюпо следующейпрограмме(табл.20).

Таблица 20

Программа амплификации

51

Детекция продуктовамплификации

Разделение продуктов амплификации проводится в 3 %-ном агарозном геле, приготовленном на ТАЕ буфере, методом горизонтального электрофореза. Для визуализации результатов электрофореза в качестве красителя вносится 1%-ный растворбромистогоэтидияизрасчета5мклна50 млрасплавленного геля.

Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжевокрасных полоспод УФ-излучением сдлиной волны 310нм.

Интерпретация результатов

При интерпретации результатов важно помнить о невозможности появления в данных анализах слабоположительных проб. Все полосы на электрофоре-

зе должны быть четкими и примерно одинаковой интенсивности (допускаются небольшие различия в яркости как между тестами на норму и мутацию, так и от пробык пробе) (табл.21и рис. 9).

Таблица21

Интерпретациярезультатов

Рис. 9. Электрофореграмма аллель-специфической ПЦР мутации BRCA1 5382insC: пациент 1 – гетерозигота (NM), пациент 2 – гомозигота по нормальному аллелю (NN)

52

Задание 1. Интерпретировать результаты электрофореграммы согласно примеру на рис. 10.

Рис. 10. Электрофореграмма анализа Ala114Val полиморфизма гена GSTP1 у больных раком молочной железы. 1- генотип Аla/Ala, 2-Ala/Val, 3- Val/Val

Вопросы для самопроверки

1.Что такое аллель-специфическая ПЦР?

2.Для чего применяется аллель-специфическая ПЦР?

3.Какая особенность ПЦР лежит в основе метода обнаружения мутаций с помощью аллель-специфической ПЦР?

53

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 10 Контаминация. Правила предотвращения контаминации

Цель занятия: ознакомление студентов с различными видами контаминации, основными мерами ее предотвращения и устранения.

Материалы и оборудование: методические материалы.

Одним из главных достоинств метода ПЦР является его высокая чувствительность. При хорошей пробоподготовке с помощью ПЦР можно определять единичные копии возбудителя инфекций. Однако данное преимущество оборачивается не менее существенной проблемой – появлением ложноположительных результатов. Это может происходить по нескольким причинам, наиболее значимой из которых является контаминация продуктами амплификации. Основным способом решения описанной проблемы является разделение ПЦР-лабораторий на несколько зон. Персонал, осуществляющий обработку биологического материала и постановку ПЦР не должен проводить электрофорез и регистрацию результатов ПЦР-анализа. В лаборатории необходимо регулярно проводить обработку рабочих поверхностей хлорсодержащими препаратами, а после работы использовать УФ-излучение с длиной волны 254 или 300 нм.

Контаминация – попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул нуклеиновых кислот, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательныерезультаты.Основными видами контаминации являются:

1. Перекрестная контаминация – кросс-контаминация (от пробы к пробе) происходит в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси и приводит к появлению спорадических ложноположительных результатов.

2.Контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются продуктами для реамплификации.

3.Контаминация следовыми количествами ампликонов лабораторной посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей

лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории, чтоприводит к появлениюсистематических ложноположительныхрезультатов.

Главным образом, загрязнения попадают в воздух из пробирок, планшетов, с рук операторов, а затем переносятся по всей лаборатории и за ее пределы и оседают на одежде сотрудников, дверных ручках, холодильниках и других контактных предметах или остаются в воздухе в виде аэрозоля. Также контаминация может произойти при проведении некоторых лабораторных процедур, например при выделении ДНК из геля для клонирования или при автоклавировании. Среди основныхтиповконтаминирущих ДНКиРНКможно выделить:

геномную ДНК;

ампликоны;

бактериальную/плазмидную ДНК;

54

кДНК (редко);

вирусную РНК.

Основными правилами предотвращения контаминации в ПЦР-лаборатории являются:

1.Разделение функциональных рабочих зон.

2.Соблюдение поточности и направления движения анализируемых об-

разцов.

3.Отдельные лабораторные халаты в каждой рабочей зоне.

4.Одноразовые перчатки без талька.

5.Наконечники для дозаторов с фильтрами, защищающими от аэрозоля.

6.Одноразовые пластиковые пробирки, посуда, наконечники.

7.Химическая и УФ-дезинфекция всех поверхностей рабочих зон.

Самый важный момент,который позволит вовремя выявить контаминацию, – постановка отрицательных контролей. Если они не проходят, то первым делом нужно поменять реагенты и пластик и использовать другой ламинарный бокс для повторной постановки реакции. Если после этого отрицательные контроли проходят, следует провести локальную деконтаминацию изначального ламинарного бокса и утилизировать контаминированные реагенты. Однако если после смены пластика, реагентов и ламинарного бокса отрицательные контроли не проходят, значит произошла более серьезная контаминация: поверхностная или воздушная. Определение типа контаминации позволяет оценить сам масштаб необходимых мер: при контаминации воздуха необходима самая сложная – объемная – деконтаминациявсего помещения.

Для анализа контаминации поверхностей нужно сделать с них смывы: нанести ПЦР-буфер на проверяемую поверхность и несколько раз ресуспендировать, а затем использовать полученный раствор в качестве матрицы для ПЦР. Чтобы проанализировать чистоту воздуха, необходимо сделать посевы из воздуха: открыть пробирку с ПЦР-буфером и подержать ее на воздухе полчаса, закрыть пробирку и использовать этот буфер в качестве ПЦР-матрицы. Если нет возможности проверить наличие ДНК в воздухе и сделать смывы с поверхностей для оценки их чистоты (например, негде поставить заведомо «чистые» реакции), следует сразу начинать деконтаминацию.

Существует несколько способов борьбы с контаминацией.

Одним из этих способов является использование фермента N-урацил- гликозилазы (УГ). В основе этого метода лежит способность УГ расщеплять молекулы ДНК со встроенным урацилом. Реакцию амплификации проводят с использованием смеси дНТФ, в которой дТТФ заменен на дУТФ (урацил), и после термоциклирования все образующиеся в пробирке ампликоны будут содержать урацил.

Если до амплификации в реакционную смесь добавить УГ, то попавшие в реакционную смесь ампликоны будут разрушены, тогда как нативная ДНК останется целой и будет в дальнейшем служить мишенью для амплификации.

Другим способом инактивации ампликонов служит фотохимическое воздействие на молекулы ДНК. Для этого используют псорален или изопсорален, которыеактивируютсякратковременным облучением ультрафиолетовым светом.

55

Модифицированные этими соединениями молекулы ДНК не могут участвовать в реакции амплификации.

Однако, как известно, ни одна биологическая или химическая реакция не идёт со 100 %-ной эффективностью и, соответственно, после инактивации продуктов амплификации из миллиардов копий амплифицированного фрагмента хотя бы несколько останутся целыми, что существенно снижает ценность такого подхода. Кроме того, всегда остается риск кросс-контаминации от образца к образцу в процессе пробоподготовки. Таким образом, оба эти метода лишь в некоторой степени позволяют устранить источник контаминации и не гарантируют отсутствия ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Есть третий способ борьбы с результатами контаминации, рассматриваемый скорее как казусный – значительное уменьшение количества циклов реакции (до 25–30 циклов). Но даже при таком подходе риск получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов велик.

Наиболее радикальным подходом для решения этой проблемы является использование флуоресцентных методов детекции, которые позволяют регистрировать результаты анализа, не открывая пробирки. Тем самым исключается этап электрофореза – основной источник контаминации.

Для уверенности в отсутствии контаминации необходимо каждую серию экспериментов сопровождать отрицательными контролями. В качестве отрицательных контролей рекомендуется использовать воду из комнаты пробоподготовки (после каждого десятого клинического образца желательно обрабатывать вместо биологического образца пробирку с водой).

Все реактивы рекомендуется хранить отдельными порциями (аликвоты). Если, несмотря на принятые меры, обнаружены следы контаминации, то все используемые порции реактивов следует заменить на новые, а все поверхности помещения, оборудования, пипетки и пр. обработать дезинфицирующими препаратами.

Для химической обработки контаминированной лаборатории рекомендуются растворы с ферментативной активностью против ДНК, РНК и РНКазы, что значительно более безопасно с точки зрения работы персонала и коррозии приборов по сравнению с ранее используемыми растворами хлорсодержащих препаратов. Доступными для использования реагентами являются спреи и рас-

творы производства AppliChem GmbH (серия ExitusPlus), Thermo Scientific (серия

AWAY) и Invitrogen (серия Alert). Порядок проведения деконтаминационных мероприятий описан в п. 1.3 МУ 1.3.2569-09 [5]. Контроль качества деконтаминации осуществляется посредством смывов с рабочих поверхностей и оборудования.

Для того чтобы предотвратить контаминацию, важно действовать комплексно. Деконтаминации традиционными средствами или облучения ультрафиолетом недостаточно. Несколько простых правил и советов помогут избежать проблему ДНК-контаминации:

проводить рутинную деконтаминацию – регулярная обработка профессиональными средствами, например DNArid;

56

использовать облучатели-рециркуляторы с высокой производительностью и фильтрами;

проводить облучение помещения ультрафиолетом по таймеру несколько раз в сутки;

убедиться в функционировании системы вентиляции или использовать альтернативные решения – фильтровые блоки с HEPA-фильтром для подачи воздуха через окно;

проводитьдеконтаминациюдозаторовсихразборкойиполнойобработкой;

вовремя обслуживать и очищать амплификаторы и центрифуги;

регулярнодеконтаминировать автоклавы– источник фрагментарной ДНК;

обеспечивать регулярную смену HEPA-фильтров ламинарных боксов и обслуживание их подрешеточных зон;

проводить микробиологический контроль воздуха – это простой и недорогой способ определить, оптимально ли работают системы вентиляции, очистки воздуха, УФ-облучения и правильно ли проводится уборка. Для этого можно использовать уже готовую чашку Петри со средой, специально разработанной для этих целей компанией «Биомедицинские инновации»;

использовать только заведомо чистую воду для всех процедур – и для ПЦР, и для пост-обработки поверхностей после деконтаминации, напри-

мер воду, обработанную ДЭПК, в спрей-флаконе;

обеспечить качественную утилизацию отходов: после проведения амплификации нужно не допустить повреждения пробирок и планшетов, а стерилизация автоклавированием не должна сама становиться источником контаминации;

в лаборатории должен быть запас неконтаминированных салфеток, дистиллированнойводы,наборовреагентовипластика,атакжелабораторнойодежды;

сотрудники лаборатории должны быть обучены всем правилам работы в ПЦР-лаборатории, в том числе в части вопросов контаминации и деконтаминации.

Задания

1.Ознакомиться с правилами и принципами деконтаминации в лабораторных условиях.

2.Ознакомится с профессиональными дезинфицирующими средствами в ПЦР-лаборатории.

Вопросы для самопроверки

1.Что такое контаминация?

2.Какие виды контаминации бывают? Дать им характеристику.

3.Перечислить основные способы борьбы с контаминацией.

4.Какие действия необходимо предпринять, если после проведения ПЦР в

отрицательном контроле появился специфический продукт?

57

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 11 Оборудование для ПЦР «в реальном времени». Проведение реакции амплификации в режиме реального времени (Real-Time PCR)

Цель занятия: ознакомение студентов с различными приборами RTPCR, программирование амплификатора, проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Материалы и оборудование: методические материалы; ПЦР-бокс; амплификатор BioRad CFX-96; набор автоматических пипеток (от 5 до 1000 мкл); вортекс; лабораторный пластик; образцы ДНК; набор «SNP-экспресс-РВ».

ПЦР позволяет выделить нужный фрагмент макромолекулы из образца и значительно увеличить его концентрацию для проведения исследования. Оборудование для проведения ПЦР востребовано при проведении биохимических, медицинских и криминалистических исследований. Также его применяют в молекулярной диагностике для точного выявления возбудителей инфекций. В ряде случаев оно помогает установить предрасположенность к генетическим заболеваниям. Оборудование для ПЦР производят такие известные бренды как

QIAGEN, Bio-Rad, Fluidigm, Eppendorf, ДНК-Технология и др.

Амплификатор Real-time CFX96 Touch (рис. 11) – флагманский высоко-

скоростной прибор для проведения ПЦР в реальном времени производства компании Bio-Rad. Запатентованная конструкция облегченного термоблока и уникальная оптическая система 6-канальной детекции обеспечивают беспрецедентно высокую скорость и удобство работы на приборе и по праву гарантируют CFX96 Touch лидирующее место как в научных лабораториях, так и на рынке ПЦР-диагностики (табл. 22).

Таблица22

Каналыдетекции АмплификатораReal-time CFX96 Touch

58

Рис. 11. Амплификатор Real-time CFX96 Touch

Амплификатор Rotor-Gene Q (рис. 12) – термоциклирующая система для проведения высокоточного количественного и качественного ПЦР-анализа в режиме реального времени (Real-time PCR), ПЦР с детекцией по конечной точке. Нагревание и охлаждение образцов обеспечивается потоком воздуха, что исключает возникновение краевого эффекта и гарантирует надежность полученных результатов. Роторная реакционная камера обладает превосходными температурными и оптическими характеристиками; широкий диапазон длин волн от УФ до ИК-области.

Рис. 12. Амплификатор Rotor-Gene Q

59

Применение

выявление возбудителей инфекционных заболеваний, одновременное определение нескольких возбудителей в одном образце;

генотипирование микроорганизмов;

определение вирусной нагрузки, мониторинг протекания инфекции;

оценка уровня экспрессии генов, анализ концентрации ГМО в пищевых продуктах.

Амплификатор Real-time ДТпрайм (рис. 13). Универсальный много-

функциональный амплификатор ДТпрайм с детекцией в режиме реального времени с различными вариантами термоблока (96 х 0.2 мл; 3 x 32 х 0,2 мл; 6 x 16 х 0,2 мл; 384 х 0,045 мл): 4/5 каналов детекции флуоресценции, температурный градиент, возможность анализа кривых плавления, цветной графический дисплей. Амплификатор с детекцией в режиме реального времени DTprime производства компании «ДНК-Технология» представляет собой универсальную, современную, высокотехнологичную систему, находящую применение в клинико-диагностических и научно-исследовательских лабораториях различного профиля с малыми, средними и большими потоками образцов.

Рис. 13. Амплификатор Real-time ДТпрайм

Системы для цифровой ПЦР

Цифровая ПЦР (digital PCR, dPCR) представляет собой усовершенствованный метод традиционной реал-тайм ПЦР, позволяющий прямой подсчет числа мишеней нуклеиновых кислот. В отличие от реал-тайм ПЦР, хорошо известного количественного относительного метода, цифровая ПЦР является абсолютным методом измерения. Концентрация ДНК-мишени определяется в исходном образце в виде числа копий в микролитре с чувствительностью до 1 молекулы.

Описание метода. Реакционная смесь с исследуемым материалом разделяется на множество микрореакторов, в каждом из которых проходит индивиду-

60