Технология ПЦР-анализа. Учебное пособие

Таблица 18

Приготовление ПААГ

Приготовление концентрирующего геля 5 мл

В посуду 10–15 мл добавить 1 мл Трис рН-6,8, 0,75 мл АА30/1 и 3,145 мл воды. Аккуратно перемешать раствор без пузырей. Добавить 50 мкл SDS, перемешать без пузырей.

Взять блок с заполимеризовавшимся разделяющим гелем, удалить из него лишнюю воду путем стекания на фильтровальную бумагу. Подготовить гребенку. Подготовить блок к заливке концентрирующего геля. Добавить к раствору для концентрирующего геля 50 мкл 10 % ПСА и 5 мкл ТЕМЕД аккуратно (без пузырей) перемешать и залить в блок, вставить гребенку для образования карманов в геле в блок. Дождаться полимеризации концентрирующего геля.

Электрофоретическое разделение ДНК

спомощью биоанализатора Agilent 2100

Всистеме применяют готовые чипы, заполненные агарозным гелем. Движение фрагментов ДНК в капилляре, как и в «классической» методике, происходит под действием тока. Для определения размеров НК и белков используют маркеры, окрашенные интеркалирующими и флуоресцентными красителями.

Электрофоретическое разделение ДНК с помощью биоанализатора происходит в специальных пластиковых чипах в системе капилляров, которые при подготовке чипа заполняются гелеобразующим раствором через соответствующие ячейки. Данный раствор содержит флуоресцентный краситель, который связывается с ДНК до застывания геля, что необходимо для последующей детекции. В каждую из двенадцати рабочих ячеек, кроме пробы, добавляется внутренний маркер – фрагменты ДНК минимального и максимального размера. Это позволяет сравнивать результаты разделения в разных капиллярах.

Вотдельную ячейку добавляется внешний маркер – смесь фрагментов ДНК известной длины, позволяющий определять размеры фрагментов ДНК в пробах. При работе прибора по очереди происходит электрофоретическое разделение фрагментов в каждом капилляре, начиная с внешнего маркера. Легкие фрагменты ДНК быстрее проходят через капилляр и, соответственно, первыми проходят мимо детектора. При этом детектор фиксирует повышение уровня флуоресценции, что отображается в виде пика на электрофореграмме (рис. 3).

41

Рис. 3. Электрофореграмма образцов после рестрикционного анализа по гену CLU

Время появления пика определяется размером фрагмента, а высота пика зависит от концентрации данного фрагмента ДНК в пробе. Одновременно на основе полученных электрофореграмм создается изображение, имитирующее электрофорез ДНК в агарозном или полиакриламидном геле (рис. 4). Таким образом, прибор позволяет получить электрофореграммы для каждого образца; изображение, имитирующее разделение в геле; таблицу, в которой приведены размер, массовая и молярная концентрации для каждого из фиксируемых фрагментов.

Рис. 4. Пример разделения ампликонов после рестрикционного анализа с помощью биоанализатора Agilent 2100

42

Необходимо держать все реагенты и смеси в холодильнике при 4 °С при неиспользовании более 1 ч. Приготовить все реагенты и образцы за 30 мин до начала постановки при комнатной температуре. Чипы после вскрытия раскапывать не более 10 мин.

Ход работы

Приготовление Gel-DyeMix

1.Добавить 25 мкл DNA dye concentrate (синий) в DNA gel matrix vial (красный).

2.Перемешать вортексированием и открутить на мини-центрифуге. Пере-

нести в спин-фильтры.

3. Центрифугировать при 5780 об/мин 15 мин. Хранить в темноте при 4 °С, использовать в течение 6 недель.

Загрузка чипов

1.Извлечь ДНК чип из пакета и поместить на станцию заливки.

2.Внести 9 мкл Gel-Dye Mix на дно лунки .

9µl gel-dye

3.Установить таймер на 60 сек, убедиться, что поршень шприца установлен на 1 мл, а затем закрыть станцию заливки. Замок щелкнет, когда станция

заправки будет закрыта правильно.

4.Нажать на поршень шприца, пока он не будет удерживаться зажимом.

5.Подождать ровно 60 сек, а затем отпустить поршень с помощью механизма освобождения зажима.

6.Визуально убедиться, что поршень перемещается назад как минимум до

отметки 0,3 мл.

7.Подождать 5 сек, затем медленно потянуть поршень назад в положение

1мл.

8.Открыть станцию заливки.

9.Внести 9 мкл Gel-Dye Mix на дно отмеченных лунок .

9µl gel-dye

10.Внести 5 мкл маркера ДНК (зеленый) в лунку, помеченную символом лестницы, и в каждую из 12 лунок для образцов.

43

Примечание! Не оставлять лунки пустыми, иначе чип не будет работать должным образом. Добавить 5 мкл зеленого маркера ДНК (зеленый plus) плюс 1 мкл деионизированной воды в каждую лунку неиспользованного образца.

11.Внести 1 мкл ДНК маркера (желтая) в лунку, отмеченную символом лестницы .

12.В каждую из 12 лунок для образцов внести 1 мкл образца (использованные лунки) или 1 мкл деионизированной воды (неиспользованные лунки).

13.Вортексировать чип в течение 60 сек при 2400 об/мин.

14.ПоместитьчипвбиоанализаторAgilent2100изапуститьвтечение5мин.

15.Запустить на ноутбуке программу 2100 Expert (рис. 5), при правильной вставке чипа программа покажет, что вставлена микросхема и закрыта крышка, отобразивзначокмикросхемывлевомверхнемуглуокна«Инструмент».

Рис. 5. Окно программы 2100 Expert биоанализатора Agilent 2100

44

16. Во вкладке инструмента выбрать соответствующий анализ в меню «Анализ».

17. Нажать кнопку «Пуск» в правом верхнем углу окна .

По завершении анализа необходимо немедленно извлечь использованный чип из биоанализатора и утилизировать его в соответствии с надлежащей лабораторной практикой. Затем выполнить следующую процедуру, чтобы убедиться, чтоэлектроды чистые(т.е.неосталосьостатковот предыдущего анализа).

1.Медленно заполнить одну из лунок очистителя электродов 350 мкл деионизированной воды. Открыть крышку и поместить очиститель электродов

вбиоанализатор Agilent 2100.

2.Закрыть крышку и оставить ее закрытой примерно на 10 сек.

3.Открыть крышку и снять очиститель электродов.

4.Подождать еще 10 сек, чтобы вода на электродах испарилась, затем за-

крыть крышку.

Вопросы для самопроверки

1.Что такое электрофорез?

2.Какие виды электрофореза выделяют?

3.Какой краситель позволяет увидеть фрагменты ДНК?

4.Как работает бромистый этидий?

5.Какие фрагменты ДНК движутся в поле быстрее? Почему?

6.От чего зависит выбор концентрации агарозы при приготовлении ага-

розного геля?

7.На чем основано электрофоретическое разделение ДНК с помощью биоанализатора Agilent 2100?

8.Во время детекции продуктов амплификации можно видеть, что некоторые ампликоны имеют разную толщину. Почему?

9.Решить задачу. На рис. 6 приведена фотография геля, на который был нанесен маркер ДНК (слева) и образец ДНК (справа), и расшифровка для ДНК-фрагментов маркера. Необходимо определить примерную длину каждого

из трех фрагментов ДНК. Соотнести фрагменты и их длину в п.н.

Рис. 6. Электрофореграмма продуктов амплификации и маркера для ДНК

45

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 8 Способы определения концентрации препаратов ДНК.

Анализ гель-электрофореграмм

Цель занятия: ознакомление со способами определения концентрации препаратов ДНК; умение проводить анализ гель-электрофореграмм.

Материалы и методы: горизонтальные камеры для электрофореза в агарозном геле; набор гребенок; источник тока; УФ-трансиллюминатор; автоматическая пипетка; лабораторный пластик; мерная колба (цилиндр) на 1000 мл; колба на 250 мл; электрическая плитка или микроволновая печь; образцы ДНК; реперная ДНК.

Для выполнении многих молекулярно-генетических операций, сопряженных с такими процессами, как трансформация бактериальной клетки, модификация, включение метки, рестрикция и лигирование ДНК, ПЦР, гибридизационные процессы и т. д., важно знать концентрацию препаратов ДНК, т. е. взять то количество ДНК, которое необходимо для проведения эксперимента.

Существуют различные способы определения концентрации нуклеиновых кислот, имеющие различные диапазоны измерения и достоверности: анализ физико-химических свойств этих соединений, спектрофотометрический способ анализа параметров исследуемого образца, либо его вязкости и плотности. Одним из анализируемых элементов является реперная ДНК, которая представляет собой удобные стандарты для определения длины двухцепочечных молекул ДНК при анализе с помощью электрофореза. Маркеры длин ДНК - стандарты для определения длины двухцепочечных молекул ДНК при анализе с помощью электрофореза в геле. Маркеры состоят из фрагментов двухцепочечной ДНК строго определенной длины. Все фрагменты имеют «тупые концы». Маркеры могут быть также использованы для приблизительной оценки массы фрагмента ДНК в образце путем сравнения интенсивности полосы образца с полосой маркера той же длины (рис. 7).

ДНК-маркер чаще всего получают с помощью направленного гидролиза плазмидной ДНК.

46

Рис. 7. Маркеры длин фрагментов ДНК

Одним из наиболее распространенных и достаточно точных методов определения концентрации препарата ДНК является метод фотометрического анализа гель-электрофореграмм.

Ход работы

1.Провести гель-электрофорез (2 %-ный агарозный гель).

2.В гель в соответствующие лунки загрузить по 2 мкл анализируемого препарата ДНК (в зависимости от природы происхождения препарата и величины лунки объем может варьировать от 0,2 до 50 мкл, обычно он составляет 2–5 мкл) и2мклреперной ДНК(сконцентрацией 0,025 мкг/мклреперной ДНК).

3.Провести разделение на фракции в оптимальных условиях (температура геля и буфера, плотность геля, напряженность электрического поля, концентрация солей).

4.Гель извлечь из электрофорезной камеры и визуализировать на трансиллюминаторе (в зависимости от типа интеркалирующего агента и параметров его флуоресценции, например, этидиум бромид).

5.Документировать результаты.

6.Проанализировать электрофореграмму (количество ДНК в каждой из фракций оценивают визуально и/или программно-аппаратно по флуоресценции интеркалирующего красителя (интенсивности и плотности свечения каждой фракции) относительно таковых реперной ДНК, которая в данном случае выступает в качестве колибровочной кривой. Электрофоретическую подвижность каждой фракции оценивают относительно реперной ДНК, при этом за стартовую точку принимают нижнюю границу лунки, за финишную – макси-

47

мальную область флуоресценции каждой из фракций, оцененную либо визуально, либо программно-аппаратно):

указать реперные ДНК и их тип;

указать для анализируемых проб: количество анализируемых дорожек; число фракций (бэндов) на дорожке; визуально определить величину размера фрагментов, выраженную в kb, определенную на основании электрофоретической подвижности выявляемых фракций (бэндов) относительно таковой реперной ДНК; количество ДНК в каждой из выявленных фракций путем визуальной оценки интенсивности и плотности свечения фракции относительно таковых реперной ДНК.

7. После того как определено количество ДНК в какой-либо из фракций или суммарное в лунке, можно, зная объем пробы, вносимой в гель для анализа, рассчитать массовую концентрацию ДНК, выраженную в нанограммах (ng) или микрограммах (μg) на микролитр (μl):

,

где m(ДНК) – масса ДНК, определенная при анализе гель-электрофо- реграммы, выраженная в ng или μg; V(пробы) – объем пробы, вносимой в гель,

вμl; с(ДНК) – концентрация анализируемого препарата ДНК, ng/μl или μg/μl.

8.Результаты оформить согласно табл. 19.

Таблица 19

Оформление результатов электрофореграммы

Определение концентрации ДНК

спомощью нанофотометра Implen NanoPhotometer N60

1.Выбрать значок нуклеиновых кислот на главном экране.

2.Чтобы изменить тип анализируемой нуклеиновой кислоты, щелкнуть dsDNA, список с доступными опциями откроется на правой стороне. Вариан-

ты: dsDNA, ssDNA, RNA miRNA, miRNA Sequence, Oligo, Oligo Sequence и Custom.

48

3.Для пункта NanoVolume выбрать объем наносимого образца – 1–2 мкл.

4.Нанести ddH20 или буфер в освещенное окно образца для эталонного измерения и выбрать blank, чтобы начать считывание.

5.Использовать безворсовую лабораторную салфетку для очистки окна для образца и зеркала перед нанесением следующего образца.

6.Нанести образец на освещенное окно и нажать кнопку sample, чтобы начать измерение.

7.Результаты будут отображены в виде графика и в числовом выражении нг/мкл.

Вопросы для самопроверки

1.Подвижность ДНК в агарозном геле.

2.Разрешающая способность метода гель-электрофореза.

3.Электрофоретический профиль.

4.Реперная ДНК: ее роль и применение. Что может выступать в качестве реперной молекулы?

5.Провести анализ электрофореграммы, представленной на рис. 8.

Рис. 8. Электрофореграмма продуктов амплификации

49

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 9 Аллель-специфическая ПЦР и последующая электрофоретическая детекция

Цель занятия: проведение аллель-специфической ПЦР и последующей электрофоретической детекции.

Материалы и оборудование: методические материалы; ПЦР-бокс; амплификатор; набор автоматических пипеток (от 5 до 1000 мкл); вортекс; лабораторный пластик; образцы ДНК; набор реагентов (НПФ «Литех») для аллельспецифической ПЦР; горизонтальные камеры для электрофореза в агарозном геле; набор гребенок; источник тока; УФ-трансиллюминатор; автоматическая пипетка; лабораторный пластик; мерная колба (цилиндр) на 1000 мл; колба на 250 мл; электрическая плитка или микроволновая печь.

ПЦР с аллель-специфическими праймерами является простым и эффективным способом обнаружения мутаций в геномной ДНК. Аллель-специфическая ПЦР позволяет находить небольшое число мутантных ДНК на фоне большого числа молекул дикого типа. Для детекции мутантной ДНК используют аллельспецифические праймеры, полностью комплементарные лишь мутантным последовательностям, что обеспечивает амплификацию только мутантной ДНК, а ДНК дикого типа в реакцию не вступает. Подобный подход позволяет обнаружить несколько десятков или сотен молекул мутантной ДНК на фоне десятков тысяч молекул ДНК дикого типа (Патрушев, 2004). Принцип метода заключается в том, что при полном совпадении последовательности специфических праймеров с комплементарной матрицей аллеля амплифицируется выбранная последовательность аллеля, а при несовпадении последнего нуклеотида на 3'-конце специфического праймерас комплементарной матрицей аллеля специфическая реакция не проходит. В этой же реакции используется пара неспецифических праймеров, которая является комплементарной к обоим аллелям и служит внутренним контролем наличия ингибирования реакции. Каждый неспецифический праймер создает с одним из специфических пару и амплифицирует специфический ПЦР продукт определенного размера.

Задания

Для проведения аллель-специфической ПЦР используется набор реагентов (НПФ «Литех»). Анализу подвергается геномная ДНК человека, выделенная из лейкоцитов цельной крови. С образцом выделенной ДНК параллельно проводятся двереакции амплификации– сдвумя парами аллель-специфичныхпраймеров.

1. Приготовить и пронумеровать пробирки для проведения амплификации вместимостью 0,5 мл (или 0,2 мл) в соответствии с количеством анализируемых проб с учетом положительных (при наличии) и отрицательных контролей. Для каждойпробы готовятся2 пробирки: аллель 1 и аллель 2.

50