Технология ПЦР-анализа. Учебное пособие

Вопросы для самопроверки

1.На какие рабочие зоны разделяется лаборатория по анализу и амплификации нуклеиновых кислот?

2.Что проводят в зоне приготовления реакционных смесей?

3.Какие приборы входят в состав зоны приготовления реакционных смесей и каково их функциональное назначение?

11

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3 Устройство и оснащение зоны пост-ПЦР

Цель: ознакомление с лабораторным оборудованием зоны анализа продуктов амплификации.

Материалы и оборудование: методические материалы; лаборатория МБЦ КБГУ.

Способность ПЦР нарабатывать ДНК даже с единственной подходящей матричной молекулы накладывает определенные условия на организацию лаборатории, использующей данную методику. Если лабораторное оборудование или реактивы будут загрязнены продуктами предыдущих реакций, это может привести к получению некорректных результатов последующих ПЦРисследований с теми же праймерами.

Зона для анализа продуктов амплификации методом электрофореза – лабораторное помещение, в котором размноженные фрагменты ДНК извлекаются из амплификационных пробирок и соответственно могут попасть в окружающую среду. Поэтому в соответствии с требованиями к ПЦР-лабораториям (МУ 1.3.1794-03, МУ 1.3.1888-04), это помещение должно быть полностью изолировано от указанных выше зон.

Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается переносить их из одного помещения в другое. Запрещается перемещение персонала из помещения для электрофореза в другие рабочие помещения лаборатории. Смена рабочей верхней одежды, головных уборов, обуви и перчаток является обязательным условием при выходе из помещения для электрофореза. Ежедневно в конце рабочего дня должна проводиться текущая влажная уборка полов разрешенными к применению дезинфицирующими средствами.

Рабочая зона должна подвергаться ежедневному обеззараживанию ультрафиолетовым излучением после окончания работы в соответствии с Руководством Р 3.5.1904-04 «Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях». Для инактивации ампликонов применяют облучение ультрафиолетом. Для обработки поверхностей столов, оборудования, инструментов применяют 0,2 %-ный раствор ДП-2Т или аналогичные ему растворы, разрешенные к применению для этих целей в установленном порядке.

Важно отметить, что в случае применения метода ПЦР в режиме «реального времени» (real-time PCR) нет необходимости в детекции продуктов амплификации методом электрофореза. Следовательно, рабочую зону в помещении лаборатории для электрофореза можно не выделять.

12

Таблица 3

Список рекомендуемого оборудования зоны электрофоретической детекции

13

Вопросы для самопроверки

1.На какие рабочие зоны разделяется лаборатория по анализу и амплификации нуклеиновых кислот?

2.Что проводят в зонепост-ПЦР?

3.Какие приборы входят в состав зоны пост-ПЦР и каково их функциональное назначение?

14

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4 Выделение генетического материала из различных объектов

Цель: ознакомление с методиками выделения нуклеиновых кислот из разного биологического материала.

Материалы и оборудование: ламинарный шкаф; термостат; микроцентрифуга; ротатор; вортекс; автоматический гомогенизатор; набор автоматических пипеток (от 5 до 1000 мкл); лабораторный пластик; водоструйный насос; образцы крови буккального соскоба растений; набор реактивов для выделения ДНК из различного биологического материала; реагенты для приготовления ратсворов.

Важнейший этап идентификации гена – выделение ДНК. ДНК может быть изолирована из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра. В качестве биоматериала могут выступать: кровь, сперма, слюна, моча, волосы, зубы, кость, ткань, букальные клетки, сигаретный окурок, конверты и почтовые марки, ноготь, жвачка, фекалии, ворсины хориона, амниотическая жидкость. Выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различных исследований и может долго сохраняться в замороженном виде. Выбор методики выделения ДНК зависит от поставленной задачи, времени, отведенного на анализ и степени очистки. В связи с этим существую различные методы выделения ДНК:

экстракция с помощью органических растворителей;

экстракция с помощью силики (диоксид кремния);

экстракция с помощью гель-фильтрации;

экстракция с помощью магнитных частиц;

экстракция на микроцентрифужных колонках;

экстракция на бумажных фильтрах;

ионообменная смола (chelex).

В связи с тем, что существуют разнообразные методы выделения и очистки нуклеиновых кислот, выбор наиболее подходящей методики основывается на следующих критериях: целевая нуклеиновая кислота, организм – источник НК, первичный материал (растения, семена, листья, продукты переработки и т. д.), ожидаемые результаты (выход, чистота, время, требуемое для очистки и т. д.), дальнейшее использование НК (ПЦР, клонирование, секвенирование, введение метки, блот-гибридизация, ПЦР – в реальном времени – RT-PCR, синтез к ДНК ипр.).

Выделение ДНК из цельной крови. Стандартный метод ферментативного гидролиза с протеиназой К и последующей фенольно-хлороформной экстракцией

Выделение ДНК можно проводить без соблюдения стерильности, но под ламинаром для исключения перекрестного загрязнения образцов ДНК.

15

1.Смешать 5 мл крови с 30 мл холодного лизирующего буфера. Центрифугировать при 4000 об/мин, при +4 °С в течение 20 мин. Если центрифуга без охлаждения, то предварительно подержать пробирки с кровью и лизирующим буфером в морозильнике 10 мин.

2.Слить супернатант, добавить к осадку 20 мл холодного лизирующего буфера, перемешать, центрифугировать при 4000 об/мин, при +4 °С в течение

10 мин.

3.Тщательно слитьсупернатант и ресуспензировать ядерный осадок в 800 мкл буфера (SolineEDTA).

4.Перенести осадок с SolineEDTA в эппендорф на 2 мл, добавить 80 мкл 10 % SDS и 20 мкл протеиназы К (10 мг/мл) слегка перемешать, добавить

SolineEDTA до 1 мл.

5.Инкубировать при 37 °С в течение 12 часов.

6.Добавить 1000 мкл забуференного фенола (фенол-Триs-HCl, pH 7,8, меркаптоэтанол (на 50 мл фенола-Триs-HCl добавить 200 мкл меркаптоэтанола, тщательно перемешать)).

7.Перемешивать в течение 10 мин до однородной массы на ротаторе.

8.Центрифугировать при 5 000 об/мин в течение 10 мин.

9.Супернатант перенести в другой (новый) эппендорф, добавить 500 мкл забуференного фенола, 500 мкл хлороформа-изоамилового спирта (24 мл хлороформа: 1 мл изоамилового спирта, тщательно перемешать).

10.Перемешивать в течение 10 мин до однородной массы не трясти!!! (на ротаторе).

11.Центрифугировать при 5 000 об/мин в течение 10 мин.

12.Супернатант перенести в другой (новый) эппендорф, добавить 1000 мкл хлороформа-изоамилового спирта.

13.Перемешивать в течение 5 мин до однородной массы на ротаторе.

14.Центрифугировать при 3 000 об/мин в течение 3 мин.

15.Супернатант перенести в коническую колбу (на 50 мл), добавить 2–3 мл охлажденного96%этанола.Плавноперемешиватьдообразования«медузы»ДНК.

16.Осторожно слить спирт, оставив «медузу» в колбе.

17.Промыть осадок 2 мл 70 % спирта для удаления солей, плавно перемешивая.

18.Промыть «медузу» ДНК 96% спиртом 1–2 раза, перенести в эппендорф.

19.Высушить ДНК (при комнатной температуре) и растворить в деинозированной воде или буфере ТЕ.

Раствор ДНК хранить при температуре 4 °С, при –20 °С – для длительного хранения.

Растворы

1. Лизирующий буфер: 109,4 г сахарозы, 25 мл 0,2 МMgCI2, 10 мл трито-

на,10 мл Триs-HCl, pH 7,6.

16

2.0,2 МMgCI2: ~ 20 г MgCI2 растворить в ~ 500 мл дистиллированной воды (удельная плотность по ариометру должна быть 1,015). Хранить в морозильнике.

3.Триs-HCl, pH 7,6: 242,2 г триса растворить в 800 мл дистиллированной воды. Добавить ~ 120 мл концентрированной HCI до рН=7,6.

4.Soline EDTA: 25 mM EDTA (pH=8), 75 mMNaCl (25 мл 0,5 М EDTA (рН=8), 7,12 мл 5 М NaCI, воды до 500 мл).

5.0,5 М EDTA (рН=8): 186,1 г двухзамещенной соли ЭДТА*2Н2О растворить в 800 мл воды, интенсивно размешивая на магнитной мешалке. Довести рН до 8 (~ 20 г NaOH).

6.5 М NaCl: растворить 292,2 г NaCl в 800 мл воды. Довести до 1 л. Простерилизовать автоклавированием.

7.10 % SDS: 100 г SDS (sodium dodecyl sulfate) растворить в 900 мл воды,

нагревая до 68 °С и помешивая на магнитной мешалке. Довести объем до 1 л.

8.Протеиназа К: 10 мг сухой протеиназы К растворить в 10 мл воды деионизованной (т. е. концентрация должна быть 10 мг/мл).

9.Забуференный фенол: перегнанный (или О.ч. фенол) растопить и довести его рН до 7,8 с помощью 1 Мтрис-HCl рН=8.

10.1 Мтрис-HCl рН=8: 121.1 гтриса растворить в 800 мл воды и довести его рН до 8 ~ 42 мл конц. соляной кислоты.

Генно-инженерные работы, как правило, начинаются с получения препаратов высокоочищенных нуклеиновых кислот. Критериями качества используемого метода очистки ДНК и РНК, как, впрочем, и других макромолекул клетки, является чистота конечного препарата, уровень фрагментации выделяемых молекул, общий выход, а также время, требуемое для проведения выделения нуклеиновых кислот.

Выделение ДНК из цельной крови методом адсорбции

Выделение ДНК из образца венозной крови, взятой из базы крови Меди- ко-биологического Центра КБГУ проводится методом адсорбции с помощью набора реактивов «DiatomТМDNAPrep 100» (изготовитель ООО «Лаборатория Изоген», г. Москва).

Метод выделения ДНК с помощью набора реактивов «DiatomТМDNAPrep 100» основан на использовании лизирующего реагента с гуанидинтиоцианатом, предназначенного для лизиса клеток, солюбилизации клеточного дебриса, а также для денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии лизирующего реагента ДНК активно сорбируется на NucleoS-сорбенте, затем легко отмывается от белков и солей спиртовым раствором. ДНК, элюированная из сорбента ЭкстраГеном Е или чистой водой, может быть напрямую использована по назначению.

17

1.В пробирку объемом 1,5 мл внести 100 мкл исследуемой пробы, добавить 400 мкл лизирующего буфера и перемешать содержимое пробирки переворачиванием (5–10 раз). Интенсивное встряхивание не рекомендуется.

2.Термостатировать пробирку со смесью 5–7 мин при температуре 65 °С. Если выделение ДНК проводится из твердого сухого мелкоизмельченного материала, то следует термостатировать 30–40 мин.

3.После термостатирования центрифугировать пробирку со смесью 10 сек при 5000 об/мин в том случае, если смесь содержит несолюбилизированный клеточный дебрис или другой нерастворимый осадок. Прозрачный супернатант целиком перенести в чистую пробирку.

4.В пробирку с чистой смесью добавить 20 мкл суспензии сорбента NucleosS следует интенсивно встряхнуть на вортексе.

5.Пробирку поместить на ротатор и перемешать 10 мин (10–20 об/мин).

6.Центрифугировать 10 сек при 5000 об/мин.

7.Осторожно, не задевая осадка, удалить супернатант с помощью водоструйного насоса.

8.К осадку добавить 200 мкл лизирующего реагента, тщательно перемешать на вортексе до полного гомогенного состояния.

Примечание: Если суспендирование затруднено (при большой нагрузке

ДНК) из-за сильного слипания сорбента, то его необходимо сначала осторожно суспендироватьпипетированием, а затем перемешать на вортексе.

9.Добавить в пробирку 1 мл рабочего раствора солевого буфера.

10.Перемешатьсодержимоепробиркипереворачиваниемпробирки5–10раз.

11.Центрифугировать 10 сек при 5000 об/мин.

12.Осторожно удалить супернатант, не задевая осадка, с помощью водоструйного насоса.

13.Добавить в пробирку 1 мл солевого буфера, перемешать содержимое пробирки на вортексе, центрифугировать 10 сек при 5000 об/мин и осторожно удалить супернатант с помощью водоструйного насоса.

14.Повторить положение 13.

15.Посушить осадок при температуре 65 °С 4–5 мин.

16.В эту же пробирку внести 50–100 мкл ЭкстраГена Е (100 мкл, если выделение ДНК проводится из 200 мкл цельной крови или другой богатой ДНК пробы).

Внимание: ЭкстраГен следует отбирать от общего объема при постоянном перемешивании!

17.Суспендировать содержимое пробирки на вортексе 5–10 сек до получения гомогенной суспезии, затем термостатировать 4–5 мин при 65 °С.

18.Еще раз суспендировать содержимое пробирки на вортексе перед центрифугированием.

19.Центрифугировать 1 мин при 10000 об/мин.

20.Перенести супернатант с ДНК в чистую пробирку.

ДНК хранить при температуре –20 °С.

18

Выделение ДНК из буккального соскоба набором реагентов «ДНК-СОРБЕНТ» (НПФ «Литех»)

Набор предназначен для выделения из следующих биоматериалов: мазки, соскобы, осадок мочи, ликвор, синовиальная жидкость, плазма или сыворотка крови, слюна, буккальный эпителий.

Состав набора: растворы 1–4, сорбент, раствор для элюции.

Взятие буккального соскоба для выделения: конец ватной палочки прислонить к внутренней стороне щеки и вращать в течение 10 сек с небольшим нажимом. Образец готов для выделения ДНК. Забор буккального эпителия следуетосуществлятьнеранее,чемчерезчаспослееды,питья,атакжекурения.

Выделение ДНК

За 10–15 мин до начала работы растворы для выделения ДНК 1 и 2 (если они хранились при температуре +2 … +8 градусов) перенести в комнатные условия для полного растворения кристаллов.

1.В пробирку на 1,5 мл внести 450 мкл 1-го раствора.

2.Внести в каждую пробирку по 100 мкл образца. В случае использования буккального соскоба в качестве исследуемого материала, поместить в пробирку палочки с буккальным соскобом ватным кончиком вниз. Отрезать палочку под крышку, закрыть пробирку и вортексировать 10 сек. Инкубировать при комнатной температуре 5–10 мин. Открыть крышку, дополнительно поболтать палочкой и аккуратно вынуть её пинцетом, прижимая к внутренним стенкам пробирки для отжима из нее жидкости. Перед каждым новым образцом пинцет следует промывать.

3.Ресуспендировать сорбент на вортексе и добавить в каждую пробирку отдельным наконечником по 25 мкл ресуспендированного сорбента.

4.Перемешать содержимое пробирок на вортексе и оставить на 5 мин при комнатной температуре.

5.Отцентрифугировать пробирки для осаждения сорбента при 10 тыс. об/мин

втечение30 сек намикроцентрифугеиудалить надосадочнуюжидкость изкаждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный аспиратор.

6.Добавить в пробирки по 400 мкл 2-го раствора. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, отцентрифугировать пробирки для осаждения сорбента при 10 тыс. об/мин в течение 30 сек на микроцентрифуге и удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный аспиратор.

7.Добавить в пробирки по 500 мкл 3-го раствора. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, отцентрифугировать пробирки для осаждения сорбента при 10 тыс. об/мин в течение 30 сек на микроцентрифуге и удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный аспиратор.

8.Повторить п. 7.

19

9.Добавить в пробирки по 400 мкл 4-го раствора. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, отцентрифугировать пробирки для осаждения сорбента при 10 тыс. об/мин в течение 30 сек на микроцентрифуге

иудалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный аспиратор.

10.Оставить пробирки с открытыми крышками при комнатной температуре на 5 мин.

11.Добавить в пробирки по 100 мкл раствора для элюции и ресуспендировать сорбент с помощью вортекса. Прогреть в термостате при температуре 60 оС 5 мин, перемешать на вортексе и осадить сорбент на центрифуге при 13–14 тыс. об/мин в течение 2 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. При постановке реакции амплификации следует не допускать попадания сорбента в реакционную смесь. Снятый с сорбента раствор ДНК можно хранить при температуре –18 … 20 °С в течение года.

Выделение ДНК из растительных объектов методом осаждения CTAB (Doyle, J.J., and Doyle, J.L. (1987)

При работе с растительными объектами выход ДНК при выделении зависит от типа ткани 0,3–200 нг ДНК на 1 мг ткани. Наибольший выход зафиксирован из эмбрионов и листьев, наименьший – из органов хранения крахмала. Получается при этом ДНК размером 40–70 тпн. Свежие листья для выделения ДНК можно хранить при –70 °С.

CTAB – сильный детергент. Он эффективно разрушает ДНК-белковые комплексы. Комплекс нуклеиновых кислот с CTAB растворим только в высокой соли (2M LiCI, 1M NaCI). Для очистки нуклеиновых кислот раствор нуклеиновых кислот в 1,5 M NaCI, 2 % CTAB можно экстрагировать хлороформом. CTAB образует нерастворимый комплекс с ДНК при концентрации соли ниже, чем 0,5 M (выпадает в осадок при добавлении 2–2,5 V EtOH или 0.7 V изопропанола). Полисахариды,мембраны,фенолы и т.п. при этом неосаждаются. После осаждения, для очистки от остатков CTAB требуется переосаждение, осадок лучше сполоснуть 80 % спиртом (CTAB в нём хорошо растворим).

В случае, если при выделении ДНК из растений нет жидкого азота, то ткань можно высушить в термостате на 37 °С (пока она не станет хрупкой), затем перетереть в тонкий порошок в обычной лабораторной ступке диаметром до 10 см с минимальным количеством оксида алюминия (минимальное количество – так чтобы не прилипало к пестику и дну ступки). Для выделения брать около 0,5 мл (в 1,5 мл пробирки Эппендорф). Если не вся ткань перетерта, хранить её можно при комнатной температуре в чистой полиэтиленовой упаковке.

20