Технология ПЦР-анализа. Учебное пособие

альная ПЦР. Распределение молекул ДНК по каплям (или лункам микрочипа) происходит случайным образом, т. е. определенная лунка может содержать или не содержать молекулу ДНК. После амплификации оценивается количество позитивных (содержащих молекулу НК) и негативных (не содержащих молекул НК) реакций. Оценка количества молекул нуклеиновых кислот в исходном образце проводится на основании распределения Пуассона. Число положительных капель напрямуюзависит от исходной концентрации мишени вобразце.

Система для капельной цифровой ПЦР QX200™ Droplet Digital PCR

(рис. 14).Система для цифровой ПЦР QX200 в каплях: ~20 000 капель из 20 мкл реакционной смеси, два канала детекции (FAM, HEX), красители TaqMan, EvaGreen. Производительность: 96 образцов за запуск.

Рис. 14. Система для капельной цифровой ПЦР QX200™ Droplet Digital PCR

Система капельной цифровой ПЦР от Bio-Rad – QX200 Droplet Digital PCR (ddPCR™), вышедшая на смену снятого с производства QX100, представляет собой третье поколение технологии ПЦР, которая позволяет определять абсолютное количество копий ДНК-мишени в образце. Чувствительность системы – одна копия ДНК на сто тысяч. Для проведения анализа не требуется использование стандартных кривых. Новая система для проведения цифровой ПЦР QX200 позволяет помимо использования ПЦР систем, основанных на TaqMan-зондах, работать с интеркалирующим красителем EvaGreen. Применяется в исследованиях диагностики наследственных заболеваний, рака, вирусной нагрузки, а также для задач определения наличия ГМО в крайне низких концентрациях и других приложениях, где требуется высокая точность и простота измерений генетического материала.

Решаемые задачи:

количественная оценка биомаркеров рака. Мутации, ассоциированные

сонкологией, часто не удается детектировать из-за их низкой концентрации по сравнению с фоновой ДНК дикого типа в том же образце. Высокая чувствительность системы QX200 позволяет детектировать и количественно оценивать мутации в концентрациях от 0,0001 % – одна на сто тысяч;

обнаружение и оценка возбудителей заболеваний. Точная количественная оценка вирусной нагрузки крайне важна для определения состояния забо-

61

левания, разработки, утверждения и оценки эффективности терапии. QX200 обладает чувствительностью, достаточной для обнаружения сверхмалых количеств вирусного генетического материала, в том числе и в сложных смесях;

определение количества копий гена (CNV). Вариация числа копий гена – один из основных типов полиморфизмов в геноме человека. CNV ассоциируется

сраком, неврологическими и аутоиммунными заболеваниями, а также с побочными эффектами при воздействии лекарственных средств. QX200 позволяет определить CNV сточностьюсоотношения1.2X,например,пятьпротив шести;

валидация и количественная оценка библиотек NGS. Используя технологии цифровой ПЦР, можно качественно и количественно оценить созданную библиотеку для наиболее эффективного использования секвенаторов;

анализ экспрессии генов. Капельная цифровая ПЦР позволяет количественно определить уровень экспрессии гена: возможна оценка минимального 10 % изменения экспрессии, в том числе и при низких концентрациях;

тестирование продуктов на наличие ГМО. С точностью до тысячных долей процента система QX200 позволяет оценить количество генетически модифицированных ингредиентов в продуктах питания, сырье и кормах.

Программы амплификации для ПЦР «в реальном времени» по своему принципиальному устройству почти не отличаются от программ для обычной ПЦР. Из особенностей можно отметить следующие.

1. В программу амплификации добавляется этап считывания флуоресцентного сигнала. Обычно считывание проводят при наименьшем значении температуры в цикле реакции (кроме случаев использования интеркалирующих красителей). Вбольшинствеслучаевэтотемпературагибридизациипраймеров.

2. Ряд приборов требуют проведения специальной процедуры калибровки оптической части прибора для исключения различных неоднородностей флуоресценции перед каждым запуском. Для этого к программе добавляется отдельный этап считывания «калибровочного» сигнала.

3. В отличие от обычных программ амплификации, для которых слишком большое количество циклов реакции может вести к ухудшению последующей электрофореграммы, для ПЦР «в реальном времени» обычно не предполагается анализ после реакции (электрофоретически) и исследователю можно рекомендо-

вать устанавливать 45–50циклов реакции внезависимостиотожидаемого Ct. Принцип метода. Система «SNP-экспресс-РВ» (НПФ «Литех», Москва)

представляет собой комплект реагентов для выявления мутаций (полиморфизмов) в геноме человека. Анализу подвергается геномная ДНК человека. С образцом выделенной ДНК параллельно проводятся две реакции амплификации – с двумя парами аллель-специфичных праймеров. В смеси присутствует интеркалирующий краситель SYBR Green, флуоресценция которого многократно возрастает при встраивании в образующийся двуцепочечный продукт.

62

Результаты анализа позволяют дать три типа заключений: гомозигота по аллели 1; гетерозигота; гомозигота по аллели 2.

Состав набора: 1) краситель SYBR Green; 2) реакционная смесь Аллель 1; 3) реакционная смесь Аллель 2; 4) разбавитель; 5) Taq-полимераза; 6) минеральное масло.

Постановка реакции амплификации

При приготовлении рабочей амплификационной смеси необходимо все компоненты добавлять отдельными наконечниками с аэрозольными барьерами (фильтрами). Такие же наконечники необходимо использовать и для внесения в пробирки препарата ДНК. Недопустимо использование для приготовления смесей реактивов из комплектов других форматов. Рабочие смеси следует готовить непосредственно перед амплификацией. После внесения образца пробирки с амплификационными смесями должны быть как можно скорее помещены в амплификатор.

1.Приготовить и расставить в указанном в протоколе измерений порядке бесцветные пробирки с оптическими крышками, соответствующие рекомендациям производителя прибора, вместимостью 0,2 мл для проведения амплификации, включая пробирки для положительного контрольного образца ДНК и отрицательного контрольного образца. Маркировка пробирок не допускается! Для каждой пробы готовятся 2 пробирки 1 (Аллель 1) и 2 (Аллель 2).

Чаще всего при проведении ПЦР с детекцией результата в режиме реального времени нанесение надписей на пробирки недопустимо. В этом случае пробирки расставляются в штативе точно в том порядке, в котором они будут стоять в приборе, и составляется карта расположения образцов.

2.За 20 мин до приготовления рабочей амплификационной смеси извлечь комплект реагентов для ПЦР из морозильника, разморозить содержимое. Пробирки с реакционной смесью и полностью размороженным раствором разбавителя тщательно встряхнуть для перемешивания содержимого. Непрозрачную пробирку с красителем SYBR Green рекомендуется сначала центрифугировать на микроцентрифуге-вортексе, чтобы сбросить капли с крышки на дно, затем встряхнуть для перемешивания содержимого и снова центрифугировать.

3.Из компонентов комплекта приготовить рабочие смеси реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу:

17,5 мклразбавителя,

2,5 мкл реакционной смеси,

0,2 мкл красителя SYBR Green.

0,2 мкл Taq-полимеразы (вносится в последнюю очередь и перед ее внесением смесь рекомендуется немного перемешать).

63

Приготовить 2 рабочие смеси: с реакционной смесью Аллель 1 и с реакционной смесью Аллель 2.

Смесь тщательно перемешать пипетированием (если объем < 200 мкл) или импульсным вортексированием.

4.Внести в приготовленныепробиркипо20 мклполученнойрабочей смеси.

5.Внести по5 мклобразца изобработанной анализируемой пробы в пробирку

срабочей амплификационной смесью Аллель 1 и в пробирку с рабочей амплификационной смесью Аллель 2. В качестве отрицательного контрольного образца вносится разбавитель, в качестве положительного контроля – положительный контрольныйобразецДНКвобъеме5мклвобатипареакционнойсмеси.

6.Пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3–5 сек при (1500– 3000 об/мин) при комнатной температуре на микроцентрифуге-вортексе (если используются плашки или стрипованные пробирки – на предназначенной для этого центрифуге; значение угловой скорости (об/мин) в этом случае может отличаться от указанного).

Детекция продуктов амплификации

Детекция продуктов амплификации осуществляется прибором автоматически в каждом цикле амплификации. На основании этих данных управляющая программа строит кривые накопления флуоресцентного сигнала по заданному для образцов каналу (рис. 15).

Рис. 15. Структура окна анализа 1 – окно отображения кривых накопления флуоресцентного сигнала; 2 – окно

построения калибровочной кривой при проведении количественного анализа; 3 – окно расположения образцов; 4 – окно отображения результатов анализа.

64

Анализ и интерпретация результатов

Результат считается положительным, если значение FAM Ct образца < 27 и отрицательным, если значение FAM Ct образца > 30 (табл. 23).

Вопросы для самопроверки

1.На чем основана ПЦР «в реальном времени»?

2.Какие бывают оборудования для ПЦР «в реальном времени»? Каковы их особенности?

3.Каковы особенности программ амплификации для ПЦР «в реальном времени»?

4.Как интерпретируются результаты после проведения ПЦР «в реальном времени»?

65

Тема для самостоятельного изучения «Перспективы практического использования ПЦР-диагностики»

В настоящее время метод ПЦР широко применяется в следующих отраслях: диагностика инфекционных заболеваний, в генетических исследованиях, для определения ГМО в продуктах питания, в ветеринарии, растениеводстве и судебно-медицинской экспертизе.

Диагностика инфекционных заболеваний. ПЦР в настоящее время является одним из наиболее важных диагностических инструментов для исследования нуклеиновых кислот. ПЦР, по сравнению с рутинными методами, обладает более высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет проводить прямое определение микроорганизмов непосредственно в клиническом материале без получения чистой культуры возбудителя. Такой подход является наиболее информативным при диагностике внутриклеточных паразитов и медленнорастущих микроорганизмов,требующихсложных условий культивирования.

Одним из наиболее перспективных направлений ПЦР-диагностики явля-

ются генетические исследования, а именно:

мутации, обусловливающие наследственные заболевания;

полиморфизмы, ассоциированные с предрасположенностью к мультифакторным заболеваниям;

онкогенетика;

фармакогенетика;

HLA-типирование;

иммуногенетика;

нарушения метаболизма и т. д.

Особую актуальность ПЦР-исследования приобретают в свете возможности использования молекулярно-генетических методов для профилактики и борьбы с неинфекционными заболеваниями (НИЗ), в первую очередь, раком, сердечно-сосудистыми, респираторными заболеваниями, сахарным диабетом.

Полимеразная цепная реакция в ветеринарии. ПЦР-диагностика дает возможность постановки точного диагноза при инфекционных заболеваниях, определения их этиологии, корректировки проводимого лечения. В наше время ветеринары разработали тест-системы для диагностики методом ПЦР таких заболеваний, как туберкулёз, сибирская язва, лейкоз, чума крупного рогатого скота, бешенство, ящур, бруцеллез, кампилобактериоз, листериоз, хламидиоз животных, классическая чума свиней, респираторно-репродуктивный синдром свиней, парвовирусная инфекция свиней, энцефаломиокардит свиней, сальмонеллёз, стафилококкоз, микоплазмоз, болезнь Марека, реовирусная инфекция, болезнь Гамборо, инфекционный бронхит птиц, ньюкаслская болезнь, чума плотоядных, вирусный энтерит норок, вирусный гепатит утят и др.

66

Полимеразная цепная реакция в растениеводстве. Вирусные инфекции культурных растений вызывают ощутимые потери урожая, заметно ухудшают качество сельскохозяйственной продукции и все чаще рассматриваются как серьезная угроза продовольственной безопасности. Важнейшую роль в предупреждении распространения вирусных инфекций играет карантинный контроль продукции растениеводства, особенно импортируемого семенного и посадочного материала. В современной фитопатологии ПЦР применяют не только для диагностики патогенов растений, но также в таксономии и филогении вироидов, вирусов, фитоплазм, бактерий, грибов, оомицетов и нематод. Эта техника широко используется для мониторинга болезней растений, а также для детекции возбудителей болезней в органах вегетирующих растений, семенах, фруктах и другой хранящейся продукции растениеводства. Применение диагностических наборов позволяет получить в течение нескольких часов быстрые и достоверные (со специфичностью анализа более 95 %) результаты, позволяющие сделать своевременную выбраковку семенного материала, а также при необходимости подобрать оптимальные состав и дозы реагентов для химической обработки растений, уменьшая тем самым потери урожая.

ПЦР в судебно-медицинской экспертизе. Первый опыт использования полимеразной цепной реакции для исследования судебно-медицинских объектов описан в 1987-1988 годах в работах по типированию локуса HLA-DQA1.

Разработки ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздравсоцразвития России в области использования ПЦР в судебной медицине позволили выделить основные направления судебно-медицинской методики анализа ДНК методом ПЦР:

исследования малого количества ДНК и ее деградации, актуальные для экспертной практики;

исследование биологических объектов разного происхождения (установление половой принадлежность объекта);

работа с образцами спермы со сниженным содержанием сперматозоидов (олигозооспермия);

исследование образцов, содержащих смесь женской и мужской ДНК;

исследование следов разной давности образования;

исследованиеследов,расположенныхнаразличныхпредметах-носителях;

исследование образцов с микробным загрязнением.

67

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1.Полимеразная цепная реакция была открыта в 1983 году a) К.Маллисом

b) Х.Хорана c) Х.Клеппе d) Т.Морганом

2.В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более

a) 500 пар оснований b)50 пар оснований c) 100 пар оснований d)3000 пар оснований

3.Геном человека состоит примерно из …… оснований

a)1 млрд пар

b)2 млрд пар

c)30 млрд пар

d)300 млрд пар

4. Прибор, используемый при проведении ПЦР:

a)дистиллятор

b)амплификатор

c)термостат

d)спектрофотометр

5.Короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18—30 оснований a) праймеры

b) матрица c) ампликоны d) гибриды

6.Искусственные условия проведения опыта:

a)in vivo

b)in situ

c)in silico

d)in vitro

7. Процесс разделения цепей ДНК называется:

a)ренатурацией

b)деконденсацией

c)денатурацией

d)релаксацией

68

8. Денатурация нитей ДНК происходит при:

a)понижении температуры

b)уменьшении pH раствора

c)повышении температуры

d)увеличении pH раствора

9.С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать

a) тысяч пар нуклеотидов

b) 20–40 тысяч пар нуклеотидов c) 100 тысяч пар нуклеотидов d) 200 тысяч пар нуклеотидов

10.Кодирующая часть гена называется:

a)интрон

b)спейсер

c)репликон

d)экзон

11.Некодирующая часть гена называется: a) интрон

b) спейсер c) репликон d) экзон

12.Удлинение цепи ДНК происходит в направлении: a) 3'→5'

b) 3'→4' c) 5'→3' d) РНК → 5'

13.Процесс при котором информация, закодированная в последовательности оснований молекулы родительской ДНК, передается с максимальной точностью дочерней ДНК называется:

a) транскрипция b) репарация c) репликация d) рекомбинация

14.В качестве биоматериала для выделения ДНК может выступать:

a)бумага

b)титан

c)букальные клетки

d)нитинол

69

15. В качестве биоматериала для выделения ДНК может выступать:

a)молоко

b)ноготь

c)агароза

d)нитинол

16. В качестве биоматериала для выделения ДНК может выступать: a) роговое вещество

b) пластик

c) ворсины хориона d) железо

17. Праймер – это: a) белок

b) фермент

c) короткий фрагмент ДНК-затрава d) нет правильного ответа

18. Короткий фрагмент ДНК-затравка для синтеза комплиментарной цепи ДНК – это:

a) фермент b) белок c) праймер

d) нет правильного ответа

19. ДНК-полимераза – это:

a) фермент для разрезания участков ДНК

b) фермент для сшивания фрагментов Оказаки c) фермент для репликации ДНК

d) нет правильного ответа

20. Амплификация генов – это:

a) метод размножения определенных последовательностей ДНК b) наличие дополнительных копий генов

c) наличие дополнительных хромосом d) нет верного ответа

21. Первым этапом ПЦР-реакции является: a) дупликация

b) репарация

c)денатурация

d)репликация

70