Технология ПЦР-анализа. Учебное пособие

Ход работы

1.Ткань растереть в ступке с жидким азотом до светло-зелёной (а не тем- но-зелёной) пудры (или использовать автоматический гомогенизатор).

2.Подготовить прогретую до +65 °С пробирку с 2xCTAB (из расчёта 25

мл 2x CTAB на 2–5 г ткани).

3.Перенести пудру шпателем в пробирку, очень хорошо и быстро перемешать.

4.Инкубировать при +65 °С минимум 20 мин (лучше 1 ч, но можно и больше: 2–3 ч).

5.Охладить до NT (комнатной температуры), добавить равный объём хлороформа: изоамилового спирта (Ch: I=24:1), перемешивать ~20 мин NT.

6.Центрифугировать 5000 об/мин. NT, 10 мин.

7.Снять водную фазу, добавить к ней 0,2V 5xCTAB.

8.Перемешать, инкубировать при 65 °С 10 мин.

9.Добавить равный объём Ch: I, перемешивать ~ 10 мин NT.

10.Центрифугировать 5000 об/мин. NT, 10 мин.

Если раствор мутный или большая интерфаза – повторить экстракцию

Ch:I (пункты 9 и 10).

11.Добавить равный объём буферадля преципитации (можно и 2–3 объёма), перемешать и оставить на 1 ч (или на ночь) при NT.

12.Центрифугировать 5000–8000 об/мин. NT, 20 мин (если ДНК не выпадает в осадок, добавить больше буфера для преципитации, оставить при комнатной температуре на 1 ч, отцентрифугировать).

13.Растворить осадок в 1–2 мл HS-TE (иногда необходим нагрев до 65°С).

14.Добавить 2V спирт (абс.), 1–2 ч при –20 °С или 30 мин при –70 °С.

15.Центрифугировать 8000 об/мин 4°С, 10 мин.

16.К осадку добавить 200 мл дистиллированной воды и 100 мл 7,5M NH4Ac (pH 7,5) 20 мин, 0 °С.

17.Центрифугировать 13 000 об/мин 4 °С, 10 мин.

18.Добавить к супернатанту 2V спирта (абс.) 20 мин при –70 °С.

19.Центрифугировать 13 000 об/мин 4 °С, 10 мин.

20.Сполоснуть 80 % спиртом.

21.Растворить в TE или воде.

Хранить при –20 °С.

Растворы

CTAB=Cetyltrimethylammoniumbromid.

21

Таблица 4

Приготовление растворов. 2xCTAB буфер (хранить при NT)

Таблица 5

Приготовление растворов. 5xCTAB буфер (хранить при NT)

22

Выделение геномной ДНК из культуры клеток

Ход работы

1.Два раза промыть клетки PBS (натрий-фосфатный буфер – Phosphate bufferedsaline,PBS), 0 °С (Отмывка клеток от ростовой среды).

2.Соскоблить клетки.

3.Центрифугировать 1000 об/мин 4 °С, 5 мин.

4.Ресуспензировать в Buf. I (из расчета ~ 4,5 мл на чашку d=8 cм) (клетки ресуспензируются в изотоническом растворе).

5.Добавить 4,5 мл Buf. I/NP40, смешать (NP-40 лизирует клеточную оболочку, но не повреждает ядерную).

6.Выдержать при 0 °С, 5 мин.

7.Центрифугировать 1000 об/мин 4 °С, 5 мин.

8.Сбросить супернатант.

9.Ресуспензировать осадок в 10 мл Buf. I (сначала вортекс осадка, а потом добавлять понемногу Buf. I и вортексировать).

10.Центрифугировать 1000 об/мин 4 °С, 5 мин, ресуспензировать в 2 мл

Buf.I.

11.Быстро смешать с 20 мл Buf.II.

12.Расщепление белков протеиназой К при 37 °С , или 56 °С >3 ч.

13.Мягко экстрагировать фенолом. Экстракция должна быть мягкой, для

того, чтобы не раздробить механически длинную геномную ДНК (можно покачивать пробирку (+45o) ~10 мин).

14.Центрифугировать в два этапа: (1) 1500 об/мин, NT, 5 мин, (2) 4500 об/мин, NT, 10 мин.

15.Мягко экстрагировать Фенол: Хлороформом, Хлороформом. Центрифугировать 4500 об/мин, NT, 10 мин.

16.Осаждение спиртом. Добавить: AcNH410M (1/4V), EtOH 96 % (2V).

17.Комочек ДНК прополоскать, перенеся типом в 70 % EtOH.

18.Подсушить (не пересушить!), растворить в TE или H2O.

19.Диализ.

20.Поместить ДНК в диализный мешок. Диализ проводить около суток против нескольких смен TE.

Растворы

23

* вода MilliQ

Spermidin (freebase), 145,2 г/M

Sperminex 3HCl, 348,2 г/M

Отсыпать и взвесить небольшое количество (~30–100 мг), рассчитать объём, растворить. Хранить при температуре –20 °С.

Таблица 9

Приготовление растворов. Buf. I/NP40 (хранить при 4 oC)

Таблица 10

Приготовление растворов. Buf. II (хранить при NT)

*перед использованием.

Вопросы для самопроверки

1.От чего зависит выбор метода выделения ДНК?

2.Какие обязательные этапы (манипуляции) включает процесс выделения

ДНК?

3.Какие методы выделения ДНК существуют?

4.Как выбрать правильный метод при выделении ДНК из различного биоматериала?

24

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5 Свойства праймеров. Расчеты по определению температуры отжига праймеров и по определению

количества прямого и обратного праймеров

Цель: ознакомление с методикой расчета температуры отжига праймеров; вычисление количества праймеров, вносимых в реакционную смесь.

Материалы иоборудование: методические материалы.

Основные параметры стандартных праймеров можно сформулировать следующим образом:

1.Длина 18–24 нуклеотида.

2.Четыре и более 3ˊ-концевых нуклеотида не должны быть комплементарны самому праймеру, праймеру в паре, пробе или иным синтетическим нуклеотидам, добавляемым в реакцию.

3.Температура отжига (annealing temperature, Ta) должна лежать в диапа-

зоне 60–70 °С.

4.Температура плавления (melting temperature, Tm) праймеров, работающих в паре для большинства приложений должна быть сходной (кроме случаев, когда разница в Tm необходима по методике).

5.Желательно, чтобы Tm 5´-концевой части праймера была выше Tm 3´-концевой части.

6.С 5´-конца праймера может быть добавлена не комплементарная матрице последовательность практически любой длины.

Во время амплификации обычно используют температуру отжига (Та) праймеров на 5 °С ниже их расчетной (Тт), которую обычно определяют с помощью олигонуклеотидных калькуляторов (см, например, http://www.nwfsc.

oaa.ov/protocols/oligoTMcalc.html). Различия между Тт у пары праймеров в 4–6 °С

обычно не сильно оказывают влияние на эффективность ПЦР, однако лучше

если их Тт совпадают. Если различия между праймерами слишком велики, то можно изменить их GC-состав, удлинив один из праймеров в соответствии с амплифицируемой последовательностью с 3- или 5-конца (в первом случае не происходит изменения размера образующегося продукта ПЦР). Для приблизи-

тельного расчета Та вручную можно воспользоваться формулами: [4(G + С) + 2(А + Т)] – 5 °С при длине праймера < = 20 н, или

62,3 °С + 0,41 °С (% G-С) – 500/длина праймера – 5 °С, при длине прайме-

ра >20 н.

Для приблизительного расчета количества праймера в реакционной смеси можно воспользоваться формулой:

х=0,228* l/aml,

где

х – концентрация одного праймера на 50 мкл амплификационной смеси; l – длина праймера (пар оснований);

а – концентрация в ОЕ (оптические единицы).

25

В настоящее время не существует теоретических алгоритмов, позволяющих точно предсказывать температуру плавления праймеров (не говоря уже об оптимальной температуре отжига). Поэтому для получения наилучших результатов необходимо подбирать температуру отжига праймеров эмпирически.

Температура отжига праймеров является одним из важнейших факторов в создании высокоспецифичной ПЦР-системы. При завышенной температуре отжига эффективность реакции будет неоправданно низкой, тогда как при заниженной температуре могут образовываться неспецифичные продукты амплификации.

Задание 1. Рассчитать температуру отжига праймеров, представленных в табл. 11.

Таблица 11

Нуклеотидные последовательности праймеров

Задание 2. Рассчитать количество праймеров для реакционной смеси, представленных в табл. 12.

26

Вопросы для самопроверки

1.Что такое праймеры?

2.Каковы основные параметры стандартных праймеров?

3.Какие параметры важны при расчете температуры отжига праймеров?

4.Какие параметры важны при расчете количества праймеров для реакционной смеси?

5.Дана последовательность ДНК:

5’ – ATCGCCGCAACGAGACGACTGCGCATCGTCTCGTTGCG – 3’ 3’ – TAGCGGCGTTGCTCTGCTGACGCGTAGCAGAGCAACGC – 5’.

В ходе ПЦР будет использоваться праймер со следующей последовательностью 5’-CGCAACGAGAC-3’. Установите длину ампликона.

27

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6 Программирование амплификатора. Амплификация специфического фрагмента

Цель занятия: ознакомлении с методом программирования амплификатора, проведения полимеразной цепной реакции.

Материалы и оборудование: методические материалы; ПЦР-бокс; амплификатор; набор автоматических пипеток (от 5 до 1000 мкл); вортекс; лабораторный пластик; образцы ДНК; набор праймеров; набор реагентов для ПЦР.

Данный метод позволяет быстро размножить специфический участок ДНК (то есть любой интересующий ген) более чем в 200 000 раз и получить более 10 миллионов копий. Чтобы провести реакцию, достаточно иметь ДНК-материал одной клетки; количество амплифицированной с помощью ПЦР ДНК столь велико, что эту ДНК можно просто окрашивать (использование радиоактивных зондов после электрофореза не требуется). Необходимое условие для проведения ПЦР – знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНКдляправильногоподбораискусственно синтезированныхпраймеров.

В настоящее время ПЦР представляет собой процесс, протекающий в одной пробирке и состоящий из повторных циклов амплификации (размножения, копирования) специфической последовательности молекулы ДНК с целью получения достаточно большого количества копий, которые могут быть идентифицированы методом электрофореза. Один из ключевых компонентов реакции – «праймеры» – синтетические олигонуклеотиды, состоящие из 20–30 оснований, комплементарных «сайтам» (участкам) отжига (присоединения) на идентифицируемом участке матричной ДНК. ПЦР протекает автоматически в программируемом термостате – термоциклере (амплификаторе), который автоматически контролирует и меняет температуру во время циклов (обычно 30–40 циклов). ПЦР представляет собой трехступенчатый процесс (цикл), который повторяется заданное количество раз.

«Классическая» программа ПЦР включает 3 температурных интервала: денатурацию молекул ДНК, отжиг праймеров и синтез ДНК, повторяющиеся

20–50 раз.

Денатурация ДНК. Денатурацию обычно проводят при 90–95 °С. Чтобы полностью денатурировать ДНК, достаточно одной секунды инкубации при температуре 90°С. Для большинства современных амплификаторов можно рекомендовать 5–10 сек инкубации для уверенной денатурации. Слишком долгая инкубация на шаге денатурации ведет к ускоренному падению активности полимеразы и, в конечном счете, снижает эффективность ПЦР.

Отжиг праймеров. Расчеты по определению температуры отжига праймеров и по определению количества прямого и обратного праймеров представлены в лабораторной работе № 5.

Элонгация. Стандартная температура элонгации при использовании Taqполимеразы дикого типа составляет 68–72 °С. При этой температуре для эффективной амплификации фрагментов в несколько сотен тпн обычно достаточно 5–30 сек элонгации.

28

Число циклов ПЦР. Число циклов программы амплификации зависит от поставленной задачи, эффективности реакции и количестваДНК-матриц на старте реакции. При максимальной эффективности реакции достаточно 38-40 циклов для получения 25–50 нг/мкл продукта амплификации с единственной исходной молекулы ДНК.

Окончательнаядостройка цепей.Длядостройки одноцепочечной фракции пробирки после ПЦР инкубируют при 72°С в течение 5–10 мин (иногда с добавлением свежей порции полимеразы). Особенно полезна достройка одноцепочечной фракции в случае, если продукт амплификации будет использован для обработки эндонуклеазами или непосредственно для реакции лигирования.

Хранение пробирок в приборе после ПЦР. Часто можно наблюдать до-

бавление в конце программы амплификации этапа «бесконечного» хранения пробирок при 4–10°С. Объективных причин использования такого приема нет, поскольку и при комнатной температуре продукт амплификации может храниться сколь угодно без заметных изменений.

Задание 1. Приготовление реакционной смеси

Проведение ПЦР с приготовлением смеси из отдельных компонентов

Ход работы

1. Приготовить планшет с реактивами и образцами растворов ДНК. Образцы растворов ДНК предварительно разморозить, перемешать на вортексе, поставить на ледяную баню.

Пример проведения амплификации с праймером гена АСЕ (Ангиотензинпревращающий фермент (АСЕ), который играет важную роль в регуляции кровяного давления через ренин-ангиотензиновую систему), характеризующийся инсерционно-делеционным полиморфизмом (I/D). Ген АСЕ располагается в хромосоме 17q23, где размеры аллелей составляют 490/190 нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность праймеров:

прямой F – 5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3', обратный R – 3'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-5'.

Для амплификации приготовить реакционную смесь объёмом 15 мкл (на один образец), которая содержит следующие компоненты (табл. 13).

29

* – объем компонентов доводится до общего объема смеси бидистиллированной водой.

Задание 2. Разнести в маркированные пробирки для ПЦР реакционную смесь в равных количествах.

Задание 3. Внести в пробирки образцы ДНК. В пробирку с отрицательным контролем (для определения чистоты постановки ПЦР) в реакционную смесь добавить вместо ДНК-матрицы – воду, равной объему вносимой ДНК.

Задание 4. Поместить пробирки в термоциклер и провести амплификацию по программе, приведенной в табл. 14.

Таблица 14

Программа постановки ПЦР

Проведение ПЦР с использованием готовой смеси – набора реагентов для ПЦР ScreenMix (ЗАО Евроген)

Разморозить реакционную смесь и тщательно перемешать.

1.Смешать компоненты реакции в последовательности, приведенной в табл. 15.

30