Технология ПЦР-анализа. Учебное пособие

2. Режим амплификации.

Таблица 16

Программа постановки ПЦР

Реакционные смеси готовят в стерильных условиях в ПЦР-боксах с использованием стерильного лабораторного пластика. После проведения амплификации все пробирки перенести в комнату для проведения детекциии визуализации ДНК и продуктов амплификации.

Вопросы для самопроверки

1.Что такое полимеразная цепная реакция? Из каких этапов состоит ПЦР?

2.Что такое праймеры?

3.Из каких компонентов готовят ПЦР-смесь?

4.Как высчитать объем воды в ПЦР-смеси?

5.Где готовят реакционные смеси ПЦР?

6.Почему для проведения ПЦР нельзя использовать ДНК-полимеразу человека, растительное масло, обычную воду?

7.Решите ситуационные задачи

 Лаборант-исследователь подготовил реакционную смесь для ПЦР, добавил в пробирку следующие компоненты:

31

двухкратный буфер для ПЦР (с Mg+);

ДНК-матрица;

прямой праймер.

Затем лаборант отвлекся на смс-сообщение, а когда вернулся к протоколу, задумался, каких компонентов не хватает в реакционной смеси. Определить, какие компоненты нужно добавить в реакционную смесь: дезоксигуанозинтрифосфат, РНК-матрица, РНК-зависимая ДНК-полимераза, дезокситимидинтрифосфат, дезоксиаденинтрифосфат, дезоксицитидинтрифосфат, ДНКзависимая РНК-полимераза, ДНК-зависимая ДНК-полимераза, обратный праймер, дезоксиуридинтрифосфат.

Рассчитать объемы компонентов в реакционной смеси по табл. 17, ДНК варьирует от 0,5 до 2 мкл.

Таблица 17

Компоненты и объем реакционной смеси

32

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 7 Детекция и визуализация продуктов амплификации

Цель занятия: ознакомление с методом электрофореза для детекции продуктов амплификации различными методами.

Материалы и оборудование: горизонтальные камеры для электрофореза в агарозном геле, набор гребенок, источник тока, УФ-трансиллюминатор, автоматическая пипетка, лабораторный пластик, мерная колба (цилиндр) на1000 мл, колба на 250 мл, электрическая плитка или микроволновая печь, биоанализатор, набор реагентов и чипов.

Проведение электрофореза является финальной стадией ПЦР. Для детекции амплифицированных фрагментов ДНК используется метод горизонтального электрофореза в агарозном геле или вертикального электрофореза в полиакриамидном геле с использованием буфера.

Электрофорез в агарозных или полиакриламидных гелях позволяет разделять молекулы ДНК по их размерам. Скорость миграции молекул ДНК в геле обратно пропорциональна логарифму их размера, и, следовательно, их молекулярного веса. С помощью количественного электрофореза определяют размер фрагментов ДНК и количество ДНК. Этот метод основан на сравнительном анализе исследуемого и стандартного препаратов ДНК на фотографии геля, окрашенного бромистым этидием.

Бромистый этидий* является интеркалирующим красителем и способен встраиваться в двухцепочечные молекулы ДНК. Ультрафиолетовый свет**, поглощенный бромистым этидием и ДНК (возбуждение передается на краситель), испускается затем в виде флюоресценции в области видимого света при 590 нм. При помощи цифрового фотоаппарата ДНК-фрагменты записываются и могут быть проанализированы (рис. 2).

Рис. 2. Электрофореграмма, демонстрирующая разделение фрагментов ДНК, амплифицированных в результате ПЦР-анализа

33

Размер фрагментов ДНК определяют путем сравнения их подвижности с маркерами молекулярных размеров (фрагментами ДНК известного размера). В качестве таких маркеров обычно используют рестрикционные фрагменты фага λ или определенных плазмидных ДНК.

Минимальное количество ДНК, которое можно увидеть при фотографировании геля, окрашенного бромистым этидием, – 2 нг при ширине полосы 0,5 см (обычная ширина лунки), оптимальное количество 40–60 нг. При количестве ДНК в полосе указанной ширины более 200 нг полоса окажется расплывчатой и будет иметь шлейф. Этот дефект особенно выражен при разделении крупных фрагментов ДНК.

Примечание!!!

*Бромистый этидий – сильный канцероген, способный проникать через кожу в организм. Следует уделять особое внимание при работе с ним. Для работы с бромистым этидием используются перчатки.

**Ультрафиолетовые лучи опасны для глаз. Поэтому при работе с ультрафиолетовой лампой нужно избегать прямого попадания лучей в глаза и использовать защищающие глаза специальные очки или маски. Материалом для очков и масок может служить стекло с примесями окиси железа (Fe2O3), например, оконное стекло (0,1 %Fe2O3).

Задания

Задание 1. Приготовление рабочего раствора буфера для электрофореза

(ТВЕх10)

Ход работы

В мерную колбу (цилиндр) на 1000 мл внести 108 г Трис (основной), 55 г борной кислоты, 40 мл (9,3 г) 0,5 М ЭДТА pH=8 (или сухой), довести до метки дистиллированной водой и перемешать до полного растворения порошка (ТВЕ буфер используется также и для приготовления агарозного геля. Готовый ТВЕ буфер может храниться при комнатной температуре в течение 2 месяцев).

Задание 2. Приготовление агарозного геля

1.Для приготовления 1 % агарозного геля в колбу на 250 мл добавить

1гагарозы к 100 мл буфера TBE (однократного).

2.Нагревать смесь в кипящей водяной бане или микроволновой печи (при максимальной мощности 2 мин) до полного растворения агарозы.Готовая агароза должнабыть прозрачной и недолжнасодержать нерасплавленныечастицы.

3.Охладить раствор агарозы до 50–55 °С и добавить бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл (около 5 мкл).

4.Залить раствор в специальную электрофоретическую кювету и немедленно вставить на расстоянии примерно 1 см от одного из концов кюветы гребенку для формирования лунок. Высота гребенки подбирается таким образом, чтобы между ее зубьями и дном кюветы оставался зазор в 0,5–1,0 мм.

34

5.Оставить камеру в строго горизонтальном положении до полного застывания геля при комнатной температуре (от 10 до 30 мин).

6.Аккуратно вынуть гребенку и поместить кювету с гелем в электрофоретическую камеру.

7.Заполнить камеру таким количеством электрофоретического буфера ТВЕ (1х), чтобы он покрыл гель слоем толщиной 1–3 мм.

8.Установить кювету с гелем в электрофоретическую камеру.

Внимание! При работе с арагозным гелем и бромистым этидием следует обязательно надевать резиновые перчатки!

Задание 3. Нанесение проб на гель

1.Отобрать из каждой пробирки по 5–10 мкл продуктов реакции амплификации, для нанесения проб на гель.

2.К 10 мкл маркера молекулярных размеров (pBR322/MspI) добавить 2 мкл 6х раствора для нанесения проб.

3.Нанести пробы в лунки геля с помощью автоматической пипетки.

4.Установить на источнике питания напряжение 100–200 В.

5.Провести электрофорез при 5–10 В/см до тех пор пока краситель не продвинется на 4–5 см.

6.Вынуть платформу с агарозным гелем из электрофоретической камеры, дать жидкости стечь с геля и осторожно промыть агарозный гель водой.

7.Осторожно перенести гель на экран УФ-трансиллюминатора.

8.Надеть защитную маску или установить защитный экран, включить трансиллюминатор и проанализировать полученные результаты.

9.Сфотографировать гель в коротковолновом УФ-свете.

Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизон-

тальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламид и специальную камеру для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК с точностью до одного нуклеотида. Однако приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного, кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в рутинной работе этот метод не используют. Оба варианта электрофоретической детекции позволяют осуществлять только качественный анализ

исопряжены с рядом проблем:

большие затраты времени на стадию детекции;

невозможность автоматизации;

сложность и субъективность трактовки результатов;

высокий риск контаминации и большие затраты на ее устранение: повышенные требования к организации лаборатории; максимальное удаление

35

зоны детекции от других зон проведения ПЦР; выделение отдельного сотрудника на стадию детекции; постоянный контроль смывов; большое количество К- для контроля контаминации ампликонами и, как следствие, увеличение объема расходных материалов и времени для подготовки кпроведениюдетекции.

Ход работы

Стекла для электрофореза протереть этиловым спиртом, установить между ними пластиковые ограничители, установить зажимы. Затем необходимо приготовить гель для электрофореза по приведенной ниже рецептуре. Последовательно смешать 2 мл 40 % полиакриламида, 2 мл 10х ТБЕ, в концентрации десятикратно превышающей концентрацию буфера. Добавить 200 мкл раствора перецилсульфата аммония (ПСА), затем влить бидистиллированную воду, доводя объем смеси до 20 мл, после этого добавить 20 мкл раствора темеда (тетраметил этилен диамид). Залить гель через проем в «ушастом» стекле, следя чтобы в заливаемом геле не образовались пузырьки воздуха, если же они образуются, их необходимо убрать. Также, в целях предотвращения образования пузырьков можно постукивать по поверхности стекла в процессе заливки геля. Сразу после заливки геля в проем в «ушастом» стекле необходимо вставить пластиковую пластину с заготовками для кармашков. После этого оставить гель сохнуть в течение 20 мин. После высыхания геля необходимо вынуть пластину с заготовками для кармашков (рекомендуется делать это под слабой струей воды для предотвращения разрушения тонких перегородок между кармашками). В этих же целях следует вынуть пластину равномерно, без перемещения пластины в стороны. Установить пластину с гелем в электрофорезную камеру, залить буфер (1 % раствор ТБЕ), с помощью пипетки продуть кармашки от воздуха. На плашку нанести по 8 мкл амплификационной смеси каждого образца, добавить по 8 мкл краски. Смесь краски с продуктом рестрикции внести в кармашки с помощью пипетки. Полностью собрать систему для проведения электрофореза и подключить ее к источнику тока: сначала форез ведется при токе 15 мА, после перехода лидирующего красителя из концентрирующего в разделяющий гель, силу тока увеличить до 30 мА (в случае использования стабилизации по напряжению – 50 и 120 В, соответственно), подождать 25–30 мин. Выключить систему, после того как полоса лидирующего красителя дойдет до нижней границы геля. Следует помнить, что для амплификации и электрофореза желательно использовать разные наборы пипеток. Необходимо все работы с пластиковой посудой выполнять при помощи простерилизованного пинцета.

Стандартным электрофоретическим методом, наиболее часто используемым в протеомике и для анализа белков, является SDS-электрофорез по Лэмли (Laemli U, 1970) в ПААГ. Этот метод использует ступенчатую буферную систему (состав буфера меняется в пространстве разделения), которая позволяет уменьшить диффузию и тем самым повысить разрешение метода.

Благодаря использованию в методе SD(L)S (sodiumdodecyl (lauryl) sulfate,

ДДС-додецил сульфат натрия, ЛСН – лаурил сульфат натрия) – разделение происходит только по их размеру.

36

SDS является анионным ПАВ (поверхностно активное вещество), его молекулы в воде несут отрицательный заряд в широком диапазоне рН. При нагревании белков в растворе с SDS происходит практически полная их денатурация и они в присутствии SDS сорбируют на себе его молекулы так, что на единицу длины полипептидной цепи приходится практически постоянное число молекул SDS. Тем самым белки приобретают отрицательный избыточный постоянный удельный заряд (приходящийся на единицу длины (массы) белка). Собственный заряд белка при такой обработке становится практически незаметным с точки зрения его влияния на подвижность молекулы белка. Как видно из описания действия SDS, белки в методе Лэмли денатурированы и теряют свою нативную конформацию.

ПААГ готовят непосредственно перед проведением эксперимента из растворов акриламида и бисакриалмида. В качестве инициатора полимеризации используют персульфат аммония (ПСА), а катализатора тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД). Смесь для образования геля, состоящую из раствора акриламида, бисакриламида, буфера, SDS, инициатора и катализатора, заливают в специально подготовленный блок (чаще всего это пластина). После изготовления (застывания, полимеризации, образования) блока геля его можно использовать для разделения в специально приспособленной для этого камере. Стандартно разделение происходит в вертикальном блоке.

Протокол SDS электрофореза по Лэмли

Необходимые реактивы

1.ТРИС (трис(гидроксиметил)аминометан, 2-амино-2-гидроксиметил-

пропан-1,3-диол,CAS N77-86-1 основание. Для электрофореза по Лэмли требования к Трис достаточно высоки. Использование реактива низких квалификаций типа Ч. или reagent, без дополнительной очистки недопустимо.

ВНИМАНИЕ!!! Использовать солянокислую соль ТРИС НЕЛЬЗЯ!!!

2.Акриламид. Идеальной является квалификация electrophoresisgrade, но часто подходят и более дешевые марки акриламида, определить пригодность можно только экспериментальным путем. Не рекомендуется использование реактива квалификации reagent,for synthesis и т. п.

3.Бис акриламид; требования к реактиву аналогичны требованиям к акриламиду.

4.SDS; желательно использование реактива квалификации for molecular biology и выше.

5.Глицин (аминоуксусная кислота); можно использовать реактив квалификации electrophoresisgrade и выше, не рекомендуется использовать реактив квалификации ч. и reagent.

6.Соляная кислота квалификации ХЧ и выше (можно использовать разбавленный до 6М реактив).

37

7.Персульфат аммония; допустимо использование реактива ч и чда после тестирования. Необходимо тестировать реактив, если он хранился после даты выпуска болееодного года.

8.Тетраметилэтилендиамин (TEMED); к нему не предъявляются очень высокие требования, но так как его расход очень небольшой, лучше использовать реактив высокого качества.

9.Глицерин можно использовать тоже без очень высоких требований – косметический, ч, чда вполне подходят.

10.2-Меркаптоэтанол (МЭ) или дитиотриэтол (ДТТ); к меркаптоэта-

нолу требования невысокие, но некоторые партии МЭ независимо от квалификации могут содержать примесь белков; установить это можно только экспериментально. К ДТТ тоже требования невысокие.

11.Бромфеноловый синий; без высоких требований.

12.Дистиллированнаявода;аналитическойилифармацевтическойчистоты.

13.Фильтровальная бумага.

Приготовление запасных растворов

1) 10% SDS 200 мл

Взвесить 20 г SDS, перенести количественно, ополаскивая небольшим (5– 10 мл) количеством воды посуду для взвешивания и собирая промывки в посуде для приготовления. Посуда для приготовления должна содержать надежную метку, указывающую объем 200 мл. Поместить в посуду для приготовлениячистыйякорь для магнитной мешалки и при постоянном перемешивании добавить сначала примерно 100 мл воды, а потом при постоянном перемешивании

ипостепенном растворении довести объем раствора водой до метки 200 мл

идождаться полного растворения. Извлечь якорь и довести объем до метки 200 мл, размешать раствор стеклянной палочкой. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Хранить при комнатной температуре (в холодильнике выпадает в осадок).

2) 30/1 акриламид (АА30/1) 100 мл

Взвесить 29 г акриламида, 1 г бисакриламида перенести количественно в посуду для растворения. Посуда для растворения должна иметь надежную метку, соответствующую объему 100 мл.

Добавить 50 мл воды, нагретой до 50–60 °С, погрузить чистый якорь магнитной мешалки, медленно при постоянном перемешивании и растворении добавлять воду до метки 100 мл, дождаться полного растворения. Извлечь якорь, довести объем до метки 100 мл водой и размешать стеклянной палочкой до гомогенного состояния. Перелить раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой, хранить на температуре +8–10 °С (нежелательно хранить при более низкой температуре, может выпасть осадок).

38

3) 1,5М Трис-HCl pH=8.8(Трис-8.8) 100 мл

Взвесить 18,2 г Трис-основания. Перенести количественно в посуду для приготовления, которая имеет надежную метку объема 100 мл. Добавить примерно 60 мл воды, погрузить в раствор чистый якорь магнитной мешалки. Поставить посуду с раствором на магнитную мешалку и включить перемешивание, добиться регулировкой оборотов небольшой скорости перемешивания (от 40 до 90 об/мин). Осторожно (чтобы на повредить электроды якорем) погрузить в раствор электрод(ы) работающего рН-метра и приступить к подведению рН с добавлением по каплям концентрированной или 6М соляной кислоты до значения 8,8. Трис относительно медленно реагирует с соляной кислотой, поэтому рекомендуется оставить раствор на ночь и проверить его рН на следующий день. При необходимости подвести рН раствора. После того как рН доведен до величины 8,8, довести водой объем раствора до отметки 100 мл при постоянном перемешивании, извлечь якорь и снова добавить воды до отметки, перемешивая раствор стеклянной палочкой. Перенести раствор

впосуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор рекомендуется хранить

вхолодильнике при температуре 4–10 °С.

4) Раствор 0,625М Трис-HCl рН-6.8 (Трис-6.8) 100 мл

Взвесить 7,57 г Трис-основания. Перенести количественно в посуду для приготовления, которая имеет надежную метку объема 100 мл. Добавить примерно 45–50 мл воды, погрузить в раствор чистый якорь магнитной мешалки. Поставить посуду с раствором на магнитную мешалку и включить перемешивание. Добиться регулировкой оборотов небольшой скорости перемешивания (от 40 до 90 об/мин). Осторожно (чтобы на повредить электроды якорем) погрузить в раствор электрод(ы) работающего рН-метра и приступить к подведению рН с помощью медленного, по каплям, добавления концентрированной или 6М соляной кислоты до значения 6,8. Трис относительно медленно реагирует с соляной кислотой, поэтому рекомендуется оставить раствор на ночь и проверить его рН на следующий день. При необходимости подвести рНраствора. После того как рН доведен до величины 6,8, довести водой объем раствора до отметки 100 мл при постоянном перемешивании, извлечь якорь и снова добавить воды до отметки, перемешивая раствор стеклянной палочкой. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор рекомендуется хранить в холодильнике при температуре 4–10 °С.

5) 10% раствор персульфата аммония (ПСА) 10 мл

Взвесить 1 г персульфата аммония в новой или чистой и сухой пробирке из полипропилена типа falcon. Добавить в пробирку воды до отметки 7 мл, закрыть герметичной пробкой и интенсивно встряхивая, перемешать. Поставить пробирку вертикально и дать стечь раствору вниз 10 мин. Довести объем раствора водой до отметки 10 мл и снова перемешать. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор хранить в холодильнике при температуре 4–10 °С.

39

6) 10х Электродный буфер 1 л

Взвесить 144 г глицина и 30 г Триса-основания. Перенести количественно в посуду для приготовления, имеющую надежную метку объема 1 л. Добавить 0,7 л дистиллированной воды, погрузить в раствор чистый якорь магнитной мешалки поставить раствор в посуде на мешалку и перемешивать до растворения, затем при перемешивании довести объем раствора до 1 л водой. Извлечь якорь, проверить объем, при необходимости довести до 1 л и перемешать стеклянной палочкой. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой.Растворрекомендуетсяхранить в холодильникепри температуре4–10°С.

Буфер для проб

Однократный буфер 20 мл

Взять мерный цилиндр на 25 мл или полипропиленовую пробирку на 50 мл с делениями (типа falcon), добавить 2 мл Трис-6,8 5 мл 10 % SDS, 2 мл глицерина, 10 мг БФС (бром феноловый синий) (можно примерно на глаз). Довести объем раствора до 20 мл, перемешать встряхиванием. Хранить при комнатной температуре.

3х Буфер для проб 10 мл

Взять полипропиленовую пробирку на 15 мл с градуировкой, типа falcon. Добавить 3 мл Трис-6.8, взвесить и перенести количественно 750 мг SDS в пробирку, добавить 3 мл глицерина, добавить 15 мг БФС (можно приблизительно, на глаз), довести раствор горячей водой (50–80 °С) до объема 10 мл и перемешать встряхиванием.

Проведение электрофореза по Лэмли

Приготовление разделяющего геля

ВНИМАНИЕ!!! Все растворы для приготовления перед смешением должны иметь комнатную температуру.

Раствор для геля 10 мл:

Взять любой сосуд, вмещающий в себя 10–15 мл раствора, добавить 2,5 мл Трис рН-8.8 и необходимое для нужной концентрации акриламида (см. табл. 18) количество раствора акриламида АА30/1 и воды.

Перемешать (без пузырей) раствор, добавить 100 мкл 10 %SDS, перемешать без пузырей. Собрать блок для заливки геля. Добавить в раствор для геля сначала 100 мкл 10 % ПСА и затем 10 мкл ТЕМЕД аккуратно размешать без пузырей и залить в блок для геля (в зависимости от конструкции наслоить на поверхность раствора в блоке небольшое количество воды). Дождаться полимеризации геля.

40