Полимеразная цепная реакция. В 2 частях. Ч.1. Теоретические основы ПЦР. Учебно-методическое пособие

УДК 577.21(075.6)

ББК 28.040Я7

А 94

Афонин А.А., Комарова Л.Н. Полимеразная цепная реакция: учебно-

методическое пособие. Ч. 1. Теоретические основы ПЦР. В двух частях [Электронный ресурс]. Обнинск: ИАТЭ НИЯУ МИФИ, 2025. 40 с.

Учебно-методическое пособие предназначено для студентов высших учебных заведений – бакалавров, специалистов, магистров и аспирантов, обучающихся по направлениям биологии и медицины.

Первая часть содержит теоретические основы ПЦР, еѐ разновидности и ключевые принципы работы метода. Вторая часть носит прикладной характер и включает описание используемого оборудования, алгоритмы постановки реакций, а также методы анализа и интерпретации полученных данных, правила оформления протокола проведѐнной работы в соответствии с современными требованиями к научной и учебной документации.

Пособие может использоваться как учебное руководство в рамках лабораторных занятий, так и как методическая основа при проведении самостоятельных исследований.

Рекомендовано к изданию Ученым советом ИАТЭ НИЯУ МИФИ от 26.06.2025.

Рецензенты:

Ляпунова Е.Р., кандидат биологических наук, доцент отделения Биотехнологий ИАТЭ НИЯУ МИФИ; Казакова Е.А., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник НИЦ

«Курчатовский институт» – ВНИИРАЭ.

3

Предисловие

Данное учебно-методическое пособие предназначено для студентов высших учебных заведений – бакалавров, специалистов, магистров и аспирантов, обучающихся по направлениям биологии и медицины. Материал пособия ориентирован как на теоретическое освоение метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), так и на его практическое применение в учебной и научно-исследовательской деятельности, включая выполнение курсовых, дипломных и диссертационных работ.

Полимеразная цепная реакция является одним из ключевых методов современной молекулярной биологии. Она широко используется в фундаментальных и прикладных исследованиях, включая диагностику инфекционных заболеваний, выявление мутаций, генотипирование, анализ экспрессии генов и оценку вирусной нагрузки. Умение грамотно планировать, проводить и интерпретировать результаты ПЦР-анализа становится неотъемлемой частью подготовки специалистов в области биологических и медицинских наук.

Пособие состоит из двух частей, каждая из которых посвящена определѐнному аспекту изучаемой методики:

1.Первая часть содержит теоретические основы ПЦР, еѐ разновидности и ключевые принципы работы метода, а также краткий глоссарий.

2.Вторая часть носит прикладной характер и включает описание используемого оборудования, алгоритмы постановки реакций,

атакже методы анализа и интерпретации полученных данных, правила оформления протокола проведѐнной работы в соответствии с современными требованиями к научной и учебной документации.

Настоящее пособие может использоваться как учебное руководство в рамках лабораторных занятий, так и как методическая основа при проведении самостоятельных исследований.

4

1 Введение в метод ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий значительно увеличить концентрацию определенных фрагментов нуклеиновых кислот (НК) в биологическом образце (пробе). Метод широко применяется для анализа малых количеств ДНК, содержащихся в исследуемом материале.

Впервые основные принципы ПЦР и состав реакционной смеси, необходимой для синтеза копий ДНК, были описаны Кьеллем Клеппе с соавторами в 1971 году. Однако тогда ещѐ не была реализована основная особенность данного метода – экспоненциальное увеличение числа копий целевого фрагмента ДНК.

В1983 году американский учѐный Кэри Муллис предложил модифицированный подход, который впоследствии получил широкое распространение под названием полимеразной цепной реакции. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) определѐнных участков ДНК в пробирке, осуществляемой в результате пот повторяющихся температурных циклов.

Вкаждом цикле ранее синтезированные фрагменты ДНК служат матрицей для дальнейшего копирования ферментом ДНКполимеразой. Это обеспечивает экспоненциальный рост числа целевых фрагментов ДНК (рис. 1.1).

Рисунок 1.1. Экспоненциальное удвоение фрагмента ДНК в ходе ПЦР

5

Широкое распространение метода ПЦР стало возможным благодаря ряду технологических достижений, произошедших в 1980-е годы. Существенную роль сыграло появление приборов для автоматического синтеза одноцепочечных фрагментов ДНК — олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров.

Важным этапом стало открытие термофильных микроорганизмов, обитающих в горячих источниках и гейзерах – Thermus aquaticus. Эти бактерии обладают уникальной ферментативной системой, способной сохранять активность при высоких температурах. Из Thermus aquaticus была выделена термостабильная ДНКполимераза, получившая название Taq-полимераза (по первым буквам названия бактерии).

Внедрение Taq-полимеразы, а также использование программируемых термоциклеров – приборов, способных автоматически изменять температуру реакционной смеси в соответствии с заданной программой, — значительно упростило проведение ПЦР. Это позволило сделать метод удобным для рутинного применения в лабораторной практике.

Без использования термостабильных полимераз (например, при применении ДНК-полимеразы человека или E. coli) фермент разрушался бы на стадии денатурации (94-95°C), и его приходилось бы добавлять заново в каждом цикле, что затрудняло автоматизацию процесса.

В настоящее время наряду с Taq-полимеразой используются и другие термостабильные ДНК-полимеразы, обладающие рядом дополнительных свойств. Одним из таких ферментов является Pfuполимераза, полученная из археи Pyrococcus furiosus. Еѐ главное преимущество – наличие механизма исправления ошибок

(proofreading).

Proofreading – это встроенная в полимеразу функция коррекции ошибок, реализуемая за счѐт 3'→5' экзонуклеазной активности. Если в процессе синтеза происходит включение неправильного нуклеотида, полимераза может «отступить назад», вырезать ошибку и вставить правильный нуклеотид, продолжая синтез (рис. 2).

6

Рисунок 1.2. Схематичное изображение работы Pfu-полимеразы.

Пояснение к рисунку 1.2:

А – к строящейся цепи подходит редкая таутомерная форма цитозина (С*), которая спаривается с аденином (А);

Б – прежде чем полимераза продолжит свою работу, цитозин претерпевает таутометрию, переходя из С* в С, таким образом новый нуклеотид теперь неправильно спарен;

В – полимераза сдвигается назад, чтобы неправильно спаренный нуклеотид оказался в 3'→5' экзонуклеазно активном сайте;

Г – Неправильно спаренный нуклеотид удаляется; Д, Е – Полимераза двигается вперед, возобновляя синтез.

Выбор ДНК-полимеразы зависит от цели ПЦР. Для задач, где необходима высокая точность (клональное секвенирование, мутагенез, генетическое конструирование), предпочтение следует отдавать Pfu-полимеразе или аналогичным ферментам с proofreading. В случаях, когда важна скорость амплификации, а точность менее критична (например, при диагностике, определении наличия гена или его экспрессии), применяется Taq-полимераза. Сравнительная характеристика двух ферментов представлена в таблице 1.

Таблица 1.1. Сравнительная характеристика Taq- и Pfu-полимераз

8

2 Основные компоненты ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод, требующий точной организации реакционной среды. Для еѐ успешного проведения необходимо наличие в реакционной смеси нескольких ключевых компонентов, каждый из которых выполняет строго определѐнную функцию.

1. Праймеры

Праймеры – это короткие, искусственно синтезированные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), длиной, как правило, 15-30 нуклеотидов, комплементарные определѐнным участкам ДНКмишени. В процессе амплификации они играют роль стартовой точки для синтеза новой цепи ДНК. Так как амплификация осуществляется по обеим цепям, для реакции требуются два праймера (прямой и обратный), каждый из которых направлен на одну из цепей матрицы. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера.

Процесс подбора праймеров – один из самых ответственных этапов разработки ПЦР-диагностикума. Необходимо подобрать такой фрагмент молекулы ДНК, который обладает высокой консервативностью и видовой специфичностью. Для этого используются специализированные компьютерные программы и данные из международных нуклеотидных баз (например, GenBank, EMBL).Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы. Ключевые требования

кпраймерам:

Специфичность. Особое внимание уделяют 3'-концам праймеров, так как именно с них Taq-полимераза начинает достраивать комплементарную цепь ДНК. Если их специфичность недостаточна, то высока вероятность, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить процессы неспецифического связывания, и синтеза фрагментов различной длинны, отличных от искомых. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.

9

Отсутствие самокомплементарности. Праймеры не должны образовывать димеры и петли, то есть не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига (комплементарного присоединения) праймеров самих на себя или друг с другом.

Отсутствие мутаций в зоне отжига. Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной специфичности, взятой в качестве критерия при выборе праймеров. При попадании на такую зону, отжиг праймеров не происходит, и, как следствие, возникает ложноотрицательный результат.

Синтез праймеров по заданной последовательности нуклеотидов осуществляется в автоматических ДНК-синтезаторах.

2. Термостабильная ДНК-полимераза

Ключевым ферментом в ПЦР является термостабильная ДНКполимераза, чаще всего – Taq-полимераза. Она синтезирует новую цепь ДНК в направлении 5′→3′, используя исходную цепь как матрицу. Обычно для проведения реакции достаточно 0.5-2.5 единиц фермента. Однако чрезмерное увеличение концентрации полимеразы может привести к снижению специфичности амплификации изза усиления неспецифических взаимодействий.

3. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ)

Смесь 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов (дНТФ) включает четыре типа нуклеотидов:

дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ);

дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ);

дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ);

дезокситимидинтрифосфата (дТТФ).

Смесь дНТФ используется полимеразой для синтеза второй цепи ДНК в качестве «строительного материала». Несбалансированная смесь дНTФ уменьшает точность работы ДНК-полимеразы. Высокие концентрации дНTФ уменьшают концентрацию свободных ионов Mg2+, что сказывается на активности ДНК-полимеразы и снижению температуры отжига праймеров.

10