Полимеразная цепная реакция. В 2 частях. Ч.1. Теоретические основы ПЦР. Учебно-методическое пособие

5.Сушка: быстрая, чтобы удалить спирт.

6.Элюция: в воде или буфере, с лѐгким подогревом.

Преимущества:

Безопасность (нет токсичных растворителей);

Быстрота (30-40 мин);

Подходит для малого объема материала;

Возможна автоматизация;

Высокая чистота. Недостатки:

Стоимость реагентов и оборудования;

Некоторые частицы плохо связывают короткие фрагменты;

Ферментативное выделение

Ферментативное выделение нуклеиновых кислот – это метод, при котором разрушение клеток и освобождение ДНК происходит преимущественно за счѐт ферментов, а не с помощью физических или химических агентов, как, например, при использовании щелочей, фенола или сильных детергентов. Данный метод часто применяется при выделении ДНК из трудноразрушаемых тканей (костная, парафинированная, формалиновая), а также в криминалистике и археогенетике (где важно сохранить целостность ДНК).

Этапы:

1.Лизис: буфер с протеиназой K, SDS, солями, EDTA.

2.Инкубация: 55-65 °C, от 30 минут до нескольких часов.

3.Очистка (опционально): осаждение спиртом, в спин-колонках или с помощью магнитных частиц.

Преимущества:

Мягкий лизис, минимальная фрагментация;

Высокая сохранность длинных фрагментов;

Безопасен – без агрессивных химикатов;

Подходит для деградированных и чувствительных образцов. Недостатки:

Длительное время выделения (от 1 часа до ночной инкуба-

ции);

21

Требуются нагрев и инкубационные условия;

Возможны загрязнения без дополнительной очистки;

Эффективность зависит от качества ферментов.

Основные параметры перечисленных методов указаны в табли-

це 5.2.

Таблица 5.2. Краткая сравнительная характеристика методов выделения НК

22

6 Методы детекции результатов ПЦР

Детекция с помощью электрофореза

Одним из наиболее распространѐнных методов детекции продуктов ПЦР – электрофорез в агарозном геле, основанный на разделении ДНК по размеру. В этом методе разделение продуктов происходит в агарозном геле, который представляет собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу с добавлением специального флуоресцентного красителя ДНК, например, бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивый комплекс, внедряясь между основаниями двойной спирали ДНК. В результате они оказываются в гидрофобном окружении, в котором бромистый этидий начинает флуоресцировать. В водной среде он этим свойством не обладает.

Гель заливается в форму с установленными гребѐнками, формирующими лунки для образцов. После застывания в лунки вносят продукты амплификации и проводят горизонтальный гельэлектрофорез, подключив источник постоянного тока.

Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют лунки, в которые вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения.

Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицатель-

но, поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду под действием сил электрического поля. Более длинные фрагменты продвигаются медленнее, короткие – быстрее. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Скорость миграции зависит от концентрации агарозы, напряжения, состава буфера, температуры и, в меньшей степени, от ГЦ-состава фрагментов.

После окончания электрофореза, гель помещают на трансиллюминатор, который излучает свет в ультрафиолетовом диапазоне (254-310 нм). УФ-излучение возбуждает флуоресценцию красителя, визуализируя полосы ДНК в оранжево-красном диапазоне (около 590 нм) (рисунок 6.1).

23

Рисунок 6.1. Разделение молекул ДНК в агарозном геле с использованием EtBr Изображение взято из открытых источников

Яркость полос продуктов амплификации может быть различной, поэтому часто в ПЦР-лабораториях принято оценивать результат по трех-, четырехили пятибалльной системе. Однако яркость полос не всегда отражает количество ДНК – она может снижаться изза ингибиторов или проблем с амплификацией.

Для оценки размеров фрагментов параллельно проводят элек-

трофорез маркера молекулярной массы – смеси ДНК-отметок известных длин (например, 100, 200, 300 п.н. и т.д.), что позволяет судить о длине ампликонов в образцах.

Во время электрофореза сами фрагменты остаются невидимыми. Чтобы отслеживать процесс, используют краситель, не взаимодействующий с ДНК, но мигрирующий с определѐнной скоростью. Он позволяет визуально определить, когда следует завершить электрофорез, чтобы не «выпустить» фрагменты за пределы геля. Его подбирают таким образом, чтобы скорость миграции наиболее подвижных макромолекул была несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда окрашенная зона доходит до конца трубки, электрофорез прекращают.

24

Преимущества агарозного геля:

относительная прочность и стабильность агарозного геля;

крупные поры (подходят для разделения больших молекул, таких как нуклеиновые кислоты);

мягкость среды (не разрушает белки и другие молекулы);

простота приготовления;

доступность и дешевизна.

Помимо агарозного геля электрофорез можно проводить в полиакриламидном геле. Он обладает большей разрешающей способностью по сравнению с агарозным и позволяет различать молекулы ДНК, отличающиеся на один нуклеотид. Однако приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного, кроме того, акриламид – токсичен, а применение метода требует специального вертикального аппарата.

В повседневной лабораторной практике полиакриламид используют редко, так как необходимость в точном определении длины ампликона до 1 п.н. возникает нечасто.

Оба варианта электрофоретической детекции позволяют осуществлять только качественный анализ и имеют ряд недостатков:

большой объѐм ручной работы и большие затраты по време-

ни;

невозможность автоматизации;

высокая субъективность в интерпретации результатов;

риск контаминации и высокие требования к организации лабораторного процесса:

изоляция зоны детекции от зоны амплификации;

постоянный контроль смывов;

обязательное использование большого количества отрицательных контрольных образцов для контроля контаминации ампликонами.

25

Флуоресцентные методы детекции

Флуоресцентные методы основаны на использовании флуорохромов – молекул, способных излучать свет при возбуждении. Детекция осуществляется специальными приборами после амплифи-

кации (ПЦР с анализом результатов по конечной точке) либо в процессе амплификации (ПЦР в режиме реального времени).

Такие методы позволяют минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и, как следствие, существенно снизить число ложноположительных результатов. В коммерческих наборах применяются два основных подхода:

1.Интеркалирующие красители

2.Гибридизационные зонды с флуорофорами

Интеркалирующие красители – молекулы, способные обра-

тимо встраиваться (интеркалировать) между двумя комплементарными парами нуклеотидов в двуспиральной ДНК или РНК. Наиболее распространенными интеркалирующими красителями являют-

ся: EtBr, SYBR Green, SYBR Gold, Eva Green и другие. Их главное преимущество – относительная дешевизна как самих красителей, так и наборов реагентов с их использованием. Однако они обладают существенными недостатоками:

Неселективность: интеркалирующие красители связываются

слюбой двухцепочечной ДНК, включая неспецифические продукты и праймер-димеры.

Требуется анализ плавления ампликонов для подтверждения специфичности;

Избыток некоторых красителей, например, SYBR Green I, способен ингибировать активность Taq-полимеразы, вызывая ложноотрицательные результаты;

Не подходит для работы с несколькими мишенями одновременно (мультиплекс ПЦР).

В связи с этим удобнее использовать наборы реагентов, в состав которых входят гибридизационные зонды. Они основаны на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), который базируется на обмене энергии между двумя фотоактивными молекулами или группами, одна из которых выступает донором

26

(первый флуоресцентный краситель), а другая – акцептором (второй флуоресцентный краситель или «темновой» тушитель) энергии. Эффективность переноса энергии зависит от взаимного расположения донора и акцептора. Гибридизационные зонды более дорогая, но значительно более точная технология, которая обладает более высокой специфичностью, позволяет делать количественную оценку и подходит для мультиплексного анализа. На данный момент существует несколько вариантов таких зондов: TaqMan,

Molecular Beacon, Scorpion, Duplex Scorpion и другие.

TaqMan-зонд – это линейный олигонуклеотид, меченый по 5'- концу флуорофором, а по 3'-концу – гасителем флуоресценции. Он отжигается внутри амплифицируемого участка, между прямым и обратным праймерами, что исключает детекцию нецелевых продуктов, которые теоретически могут образоваться в результате неспецифического отжига. В процессе ПЦР Taq-полимераза разрушает зонд, отделяя флуорофор от гасителя и увеличивая сигнал (рис.

6.2).

Преимущества использования TaqMan-зондов:

Простота конструкции;

Высокая специфичность;

Не детектирует неспецифические продукты.

27

Рисунок 6.2. Принцип работы TaqMan-зонда

Второй по популярности гибридизационной системой считаются так называемые молекулярные маяки (Molecular Beacons) или зонды-шпильки. Это шпилечные олигонуклеотиды, концы которых спарены и несут флуорофор и гаситель флуоресценции. При гибридизации с мишенью шпилька раскрывается, что приводит к пространственному отдалению флуорофора и гасителя и, соответственно, к увеличению интенсивности флуоресценции (рисунок

6.3).

28

Рисунок 6.3. Принцип действия молекулярных маяков

Преимуществами данной системы являются эффективное тушение флуоресценции в нативной форме, за счет сближенного расположения красителя и тушителя и высокая специфичность (по сравнению с интеркалирующими красителями). Главный недостаток данной системы заключается в необходимости сложного конструирования зондов и индивидуальной оптимизации условий ПЦР.

Одними из самых высокоспецифичных являются системы Scorpion и Duplex Scorpion, что обеспечивается необычным строением данных зондов, состоящих из двух последовательностей: затравочной и гибридизационной (рисунок 6.4). Специфичный оли- гонуклеотид-затравка, расположенный в начале праймера, отделяется от расположенного рядом с ним гибридизационного зонда этиленгликольным спейсером, не позволяющим ДНК-полимеразе использовать в качестве матрицы гибридизационную часть праймера.

29

Рисунок 6.4. Принцип действия молекулярных маяков типа «Скорпион» Зонд скорпион имеет модули молекулярного маяка и праймера для ПЦР

Несмотря на разнообразие вариантов конструирования систем для идентификации мишени, существуют два базовых подхода к детекции результатов ПЦР-анализа с использованием гибридиза- ционно-флуоресцентных технологий: ПЦР с анализом по конечной точке (End-point PCR) и ПЦР в режиме реального времени (Real-

Time PCR, ПЦР-РВ).

30