Полимеразная цепная реакция. В 2 частях. Ч.1. Теоретические основы ПЦР. Учебно-методическое пособие

4. Буферный раствор

Буфер обеспечивает стабильные условия среды, необходимые для работы фермента. Он содержит сбалансированную смесь катионов и анионов, поддерживает оптимальное значение рН и ионную силу раствора, способствуя эффективности ферментативной реакции.

5. Ионы магния (Mg2+)

Ионы Mg2+ необходимы для функционирования Taqполимеразы. Диапазон рабочих концентраций – 0.5-5.0 мM. Увеличение концентрации Mg2+ оказывает очень сильное влияние на специфичность и эффективность полимеразной цепной реакции, например увеличние концентрации ионов до 10 мM – ингибирует ДНК-полимеразу на 40-50%.

Влияние Mg² :

Повышение концентрации увеличивает выход ПЦРпродукта, но снижает специфичность;

Mg² образует комплексы с дНТФ, которые являются субстратом для полимеразы;

Избыток Mg² повышает температуру плавления ДНК и может снижать точность гибридизации праймеров.

Оптимальная концентрация подбирается индивидуально в зави-

симости от последовательности матрицы и праймеров.

6. Анализируемый образец

Это биологический материал, содержащий потенциальную мишень для амплификации – исследуемую ДНК. При отсутствии целевой последовательности специфический продукт амплификации не образуется.

11

3 Виды контроля при проведении ПЦР

Контрольные образцы играют ключевую роль в обеспечении достоверности результатов полимеразной цепной реакции. Их использование позволяет оценить:

эффективность амплификации;

специфичность реакции;

наличие возможных контаминантов;

корректность проведения анализа;

возможность количественного анализа ДНК.

Использование контролей при постановке ПЦР позволяет решить ряд задач, в первую очередь касающихся оценки эффективности процесса амплификации и контроля специфичности полученных результатов, а также дает возможность реализовать подход к количественному анализу ДНК.

Положительный контроль

Положительный контрольный образец (ПКО или К+) – это специально синтезированная олигонуклеотидная последовательность, идентичная целевому фрагменту ДНК. Он позволяет подтвердить, что:

все компоненты реакционной смеси активны;

условия проведения ПЦР оптимальны;

сама методика работает корректно.

Наличие продукта амплификации в положительном контроле позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции.

Отрицательный контроль

Отрицательный контрольный образец (ОКО или К-) содержит все компоненты ПЦР, за исключением исследуемой нуклеиновой кислоты. Вместо ДНК в реакционную смесь добавляют деионизованную воду или буферный раствор, не содержащий целевой ДНК. В данном контексте отрицательный контроль также маркируют как

NTC (No Template Control).

12

Назначение ОКО:

выявление возможной контаминации реактивов;

исключение ложно положительных результатов;

оценка чистоты реакционной среды.

Наличие амплифицированного продукта в отрицательном контроле свидетельствует о загрязнении или технической ошибке.

Внутренний контроль

Внутренний контроль (ВК) – это контрольный фрагмент ДНК, который вносится в каждую пробирку с реакционной смесью вместе с исследуемым образцом. Его основная функция – контроль процесса амплификации в каждой конкретной пробе.

ВК позволяет выявить:

отсутствие одного из компонентов реакции (например, праймеров, дНТФ или самой ДНК);

снижение активности фермента из-за нарушения условий хранения;

ошибки при дозировании компонентов;

ингибирование реакции.

Отсутствие сигнала от внутреннего контроля указывает на возможный сбой в проведении анализа.

Для повышения надѐжности и информативности ПЦР-анализа в состав реакционной смеси или схемы постановки анализа могут включаться следующие элементы:

Маркеры длины фрагментов ДНК – используются при электрофоретическом анализе для определения размера ПЦР-продукта;

Контроль фона – позволяет оценить уровень фоновой амплификации или неспецифических продуктов;

Стандарты и калибраторы – применяются для количественной оценки содержания ДНК;

Контроль взятия материала (КВМ) – подтверждает корректность отбора и наличия достаточного количества клеточного материала (например, контроль амплификации гена β-глобина в клинических образцах).

13

4 Основные этапы ПЦР

Если реакционная смесь приготовлена правильно, а в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходят изменения, которые обеспечиваются определенными температурными циклами. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов:

1. Денатурация (плавление)

Это переход ДНК из двухнитевой формы в однонитевую при разрыве водородных связей между комплементарными парами оснований противоположных цепей ДНК под воздействием высоких температур. На этом этапе реакционную смесь нагревают до 9495°С в течение 10-40 секунд.

2. Отжиг (гибридизация праймеров)

На этом этапе происходит присоединение праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Прямой и обратный праймеры присоединяются комплементарно к соответствующим участкам на противоположных цепях ДНК на границах целевого специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, которая обычно колеблется в пределах 50-65°C. Время отжига составляет 10-60 секунд. Этот процесс происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа. Если правило нарушено, отжиг праймеров не происходит.

3. Элонгация (синтез).

После отжига праймеров полимераза начинает комплементарное достраивание второй цепи ДНК с 3'-конца праймера. В качестве строительных блоков для синтеза новых цепей ДНК используются 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты (дНТФ). На этом этапе температуру в реакционной смеси повышают до оптимальной для работы полимеразы (для Taq-полимеразы – 72°C). Время элонгации зависит от длины амплифицируемого фрагмента ДНК и скорости работы полимеразы. Обычно расчѐт времени элонгации производится по формуле 4.1:

14

где tэлонг – это время элонгации, а N – количество пар оснований в амплифицируемом фрагменте ДНК.

Температурный цикл амплификации многократно повторяется (35-45 раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается (рис. 1.1).

Результатом циклического процесса является экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента ДНК, которое можно описать формулой 4.2:

где А – количество специфических (ограниченных праймерами) продуктов реакции амплификации; М – начальное количество ДНК-мишеней; n – число циклов амплификации.

При большом количестве циклов (30-40), вклад «-n-1» становится незначительным на фоне экспоненты, поэтому формулу 2 можно упростить, в ходе чего получаем формулу 4.3:

Однако на практике эффективность ПЦР-амплификации ниже теоретического максимума за счѐт амплификации неспецифических фрагментов ДНК и истощении компонентов реакции. Реальное значение эффективности отдельных циклов амплификации составляет, по некоторым данным, 78-97%.

Завершающая достройка. Обычно, после последнего цикла ПЦР-амплификации, реакционную смесь инкубируют дополнительно в течении 5-15 мин при 72°С для достройки частично синтезированных продуктов ПЦР.

Эффект плато

Процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает. Это явление называется эффектом плато (рисунок 4.1, 3).

Эффект плато описывает процесс накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0.3-1 пмоль.

15

Рисунок 4.3. Сигмоидальная кривая амплификации

(детектирующий амплификатор QuantStudio 5, Thermo Fisher Scientific) 1 – инициация (ПЦР-продукты ещѐ не детектируются)

2 – экспоненциальная стадия (экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла ПЦР)

3 – плато

4 – отрицательный контроль

На достижение эффекта плато влияют несколько факторов:

утилизация субстратов (дНТФ и праймеров);

стабильность реагентов (дНТФ и ферментов);

количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНКдуплексы;

неспецифические продукты и праймер-димеры, которые конкурируют за праймеры, дНТФ и полимеразу;

концентрация специфического продукта за счет неполной денатурации при высокой концентрации ампликонов.

16

5 Методы выделения нуклеиновых кислот

Основная задача при выделении ДНК из различных биоматериалов – разрушить клетки и очистить нуклеиновую кислоту от белков и прочих примесей, чтобы получить препарат, пригодный для дальнейших молекулярных анализов, таких как ПЦР.

Современные подходы включают как классические методы, так и коммерческие наборы, которые позволяют автоматизировать процесс и получать высокоочищенную ДНК. Каждый метод имеет свои особенности, преимущества и ограничения.

Наиболее распространѐнныеи прогрессивные методики выделения ДНК:

Фенол-хлороформная экстракция;

Выделение на спин-колонках;

Метод CTAB;

Выделение на магнитных частицах;

Ферментативное выделение.

Фенол-хлороформная экстракция

Классический и универсальный метод, обеспечивающий высокую степень очистки ДНК. Основан на использовании органических растворителей и протеиназы К. Метод простой и надежный, существует в ряде модификаций, как и многие другие методы. Несмотря на эффективность, метод трудоѐмкий и токсичен.

Этапы: 1. Лизис:

Механическое разрушение (например, измельчение);Химическое воздействие (TES, SDS);

Ферментативное разложение белков (протеиназа K);Центрифугирование.

2. Очистка:

Обработка фенолом/хлороформом/изоамиловым спиртом;

Разделение фаз – белки уходят в органическую фазу, ДНК остаѐтся в водной;

Удаление остатков фенола хлороформом.

17

3. Осаждение:

Добавление холодного 96% этанола;

Выпадение ДНК в виде нитей;

Промывание 70% этанолом. 4. Растворение:

Осадок растворяют в TE-буфере или деионизированной воде;

EDTA защищает ДНК от нуклеаз.

Преимущества:

Высокая чистота и выход;

Подходит для разных типов образцов (ткани, бактерии, кровь, археоматериалы);

Не требует дорогих материалов;

Удаляет белки и липиды;

Сохраняет длину ДНК (важно для long-read секвенирования). Недостатки:

Токсичность реагентов (особенно фенола);

Трудоѐмкость и много этапов;

Риск контаминации и потерь;

Сложность автоматизации;

Остатки фенола могут ингибировать ПЦР;

Не удаляет РНК без добавления РНКазы.

ВАЖНО! Фенол весьма ядовит. При вдыхании вызывает нарушение функций нервной системы. Пыль, пары и раствор фенола раздражают слизистые оболочки глаз, дыхательных путей, кожу, вызывая химические ожоги. Попадая в организм, фенол очень быстро всасывается даже через неповрежденные участки кожи и уже через несколько минут начинает воздействовать на ткани головного мозга. Даже при воздействии минимальных доз фенола наблюдается чихание, кашель, головная боль, головокружение, бледность, тошнота, упадок сил. Тяжелые случаи отравления характеризуются бессознательным состоянием, синюшностью, затруднением дыхания, нечувствительностью роговицы, скорым, едва ощутимым пульсом, холодным потом, нередко судорогами.

18

Метод CTAB

CTAB – это цетилтриметиламмоний бромид, катионный детергент, который широко используется для выделения ДНК. Данный метод особенно эффективен при работе с растениями, содержащими много полисахаридов и полифенолов.

Этапы:

1.Измельчение: в жидком азоте.

2.Лизис: в нагретом CTAB-буфере с β-меркаптоэтанолом.

3.Очистка: экстракция фенолом/хлороформом/изоамилом или хлороформом/октанолом.

4.Осаждение: в холодном изопропаноле.

5.Промывка: 70% этанол.

6.Ресуспензия: в TE-буфере или воде.

Преимущества:

Отлично работает с растениями и ингибиторами ПЦР;

Высокий выход при правильной очистке;

Поддаѐтся модификации под разные образцы. Недостатки:

Используются токсичные реагенты;

Метод длительный и трудоѐмкий;

Требует аккуратности при разделении фаз;

CTAB чувствителен к концентрации NaCl.

Выделение на спин-колонках

Широко используемый метод, основанный на селективном связывании ДНК с силикагелем, покрывающим мембрану внутри спин-колонки, при наличии определѐнных условий – обычно это высокая концентрация солей и/или низкий pH. В таких условиях ДНК прочно адсорбируется на мембране, в то время как белки, РНК и другие примеси проходят через неѐ.

Этапы: 1. Лизис:

Буфер с детергентами и протеиназой K;

Добавление RNase по необходимости.

19

2. Связывание:

Добавление буфера с гуанидиновой солью;

Центрифугирование – ДНК адсорбируется на мембране. 3. Промывка:

Солевой буфер для удаления белков;

Этаноловый буфер для удаления солей;

Сушка мембраны.

4. Элюция:

ДНК вымывают TEили EB-буфером, иногда подогретым.

Преимущества:

Быстрота (20–40 мин);

Высокая степень очистки;

Универсальность для разных типов образцов. Недостатки:

Дороговизна наборов и расходников;

Возможны потери ДНК при нарушении протокола;

Низкие выходы при малом объѐме биоматериала;

Неэффективна при сложных матрицах (слизь, полисахари-

ды);

Плохо удерживает короткие фрагменты ДНК;

Риск кросс-контаминации;

Колонки одноразовые;

Выделение на магнитных частицах

Выделение на магнитных частицах является своего рода усовершенствованием метода выделения ДНК на спин-колонках. Метод основан на связывании ДНК с покрытыми магнитными частицами, что позволяет автоматизировать процесс и обойтись без центрифуг.

Этапы:

1. Лизис: буфер с солями, детергентами, протеиназой K.

2.Добавление частиц: вместе с связывающим буфером.

3.Связывание: инкубация 5-10 мин.

4.Очистка: на магнитном штативе удаляют жидкую фазу, промывают спиртом.

20