Полимеразная цепная реакция. В 2 частях. Ч.1. Теоретические основы ПЦР. Учебно-методическое пособие
.pdfПЦР с анализом результатов по конечной точке – это моди-
фикация метода ПЦР, которая позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации.
Одним из таких вариантов является метод FLASH, основанный на специфической гибридизации флуоресцентно меченных зондов в процессе амплификации. Для проведения амплификации анализа результатов ПЦР FLASH используют специальное оборудование: термоциклеры и специализированные фруоресцентные ПЦР детекторы. В процессе своей работы прибор регистрирует флуоресцентное излучение, возникающее в реакционной смеси при освещении образца источником возбуждающего света. Регистрация производится последовательно для каждой из пробирок при ее позиционировании относительно оптического блока.
Плюсы:
Простота выполнения.
Недорогие приборы. Минусы:
Только качественная оценка (присутствует/отсутствует).
Низкая диагностическая чувствительность.
ПЦР в режиме реального времени позволяет одновременно проводить амплификацию и мониторинг флуоресценции. Преимуществом данного подхода является возможность количественного определения специфической последовательности НК в образце после каждого цикла амплификации. Для анализа результатов ПЦРРВ используют специальные ДНК-амплификаторы с оптическим блоком, позволяющие детектировать флуоресценцию внутри реакционной пробирки в ходе амплификации (рис. 6.3).
Детектируемый флуоресцентный сигнал отображает три фазы:
1.Базовая линия – сигнал неотличим от фона.
2.Экспоненциальная фаза – рост продукта, усиление сигнала.
3.Плато – насыщение, реакция замедляется.
31
Рисунок 6.3. Результаты исследований в формате ПЦР-РВ
(детектирующий амплификатор QuantStudio 5, Thermo Fisher Scientific) 1 – Положительный результат, 2 – Положительный результат 3 – Отрицательный результат, 4 – Отрицательные контроли
Сигнал флуоресценции в ходе ПЦР возрастает пропорционально количеству продукта амплификации. Мониторинг сигнала позволяет построить кинетическую кривую реакции. Ключевым пара-
метром является пороговый цикл (Ct) – точка, в которой сигнал флуоресценции начинает устойчиво превышать фон. Чем выше начальное количество ДНК, тем раньше возникает флуоресцентный сигнал.
Преимущества ПЦР-РВ:
Возможность мультиплексного анализа (одновременное определение нескольких мишеней).
ОТ-ПЦР – обратная транскрипция и количественная оценка экспрессии РНК.
Анализ плавления – верификация продуктов по температуре денатурации.
Автоматизация и стандартизация процесса.
Высокая чувствительность и специфичность.
32
7 Контаминация
Контаминация – это попадание в реакционную смесь посторонних ДНК-молекул, как специфических, так и неспецифических, способных служить матрицей в реакции амплификации. Такое загрязнение может привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам, что особенно критично при диагностике и анализе чувствительных образцов.
Источники контаминации:
Лабораторное оборудование (пипетки, наконечники, пробирки), на которых могут сохраняться следы ДНК после предыдущих экспериментов.
Перекрѐстная контаминация между образцами при неаккуратной работе.
Продукты предыдущих ПЦР, обладающие высокой стабильностью и способные служить матрицей в новых реакциях даже в следовых количествах.
Для уменьшения риска загрязнения и повышения надѐжности результатов, необходимо строго соблюдать правила ПЦР-гигиены.
Основные меры профилактики:
Пространственное разделение этапов (отдельные зоны или помещения для выделения, амплификации и детекции продуктов ПЦР).
Работа в ламинарном шкафу или изолированном боксе, оснащѐнном УФ-лампой. В этом боксе следует хранить пипетки, микроцентрифугу и расходные материалы, предназначенные исключительно для этапа подготовки ПЦР.
Использование фильтровальных наконечников и отдельного набора пипеток для работы с компонентами ПЦР.
Использование стерильных одноразовых материалов и новых перчаток при каждом новом этапе работы.
Никогда нельзя использовать повторно промытые пластиковые расходные материалы – только новые, неиспользованные пробирки и наконечники.
33
При использовании реактивом несколькими сотрудниками, их необходимо разделить на индивидуальные аликвоты, чтобы избежать перекрѐстного загрязнения.
Одним из эффективных способов разрушения посторонней ДНК в компонентах реакционной смеси (без матрицы) является их обработка ультрафиолетовым излучением в течение 10 минут. УФоблучение приводит к разрушению ДНК-цепей и снижает вероятность их участия в амплификации.
ПЦР является высокочувствительным методом, в связи с чем крайне важна тщательная дезинфекция рабочей зоны для предотвращения контаминации. Основные методы дезинфекции:
1.Обработка раствором хлорсодержащих соединений (0.5-
1% NaOCl или «Белизна»).
Уничтожает ДНК и РНК, включая ампликон-продукты. Применяется для предварительной обработки рабочих поверхностей, инструментария и отходов. Важно тщательно смывать после действия (через 10–15 минут) дистиллированной водой, чтобы избежать коррозии оборудования.
2.Обработка 70% этанолом или изопропанолом.
Обеспечивает быструю антисептическую обработку, но не раз-
рушает нуклеиновые кислоты. Используется как завершающий этап очистки поверхностей и рук.
3. Обработка ультрафиолетовым излучением (УФ).
Применяется для деградации ДНК на поверхности боксов, столов, крышек центрифуг. Включается на 15-30 минут до и после работы. УФ-обработка эффективна только на открытых участках, не действует через пластик или тень.
4. Использование специализированных растворов для раз-
рушения ДНК (например, DNA-ExitusPlus, DNA-OFF).
Комбинируют химическую и ферментативную деструкцию нуклеиновых кислот. Не требуют последующего смывания и являются безопасными для большинства поверхностей.
34
8 Оборудование для ПЦР
Список стандартного оборудования, необходимого для выделения нуклеиновых кислот:
1.Ламинарный бокс (класс II);
2.Центрифуга;
Ротор для микропробирок типа «Eppendorf» на 1.5/2 мл;
Ротор для стандартных 96-луночных планшетов (опционально);
С возможностью охлаждения (опционально);
3.Вортекс (вихревой миксер);
4.Термостат или водяная баня;
5.Микропипетки и наконечники;
6.Жидкий азот или лѐдогенератор (опционально);
7.Магнитный штатив (опционально)
8.Микрогомогенизатор под микропробирки типа «Eppendorf» (опционально).
Список оборудования, необходимого для проведения полимеразной цепной реакции и последующей детекции результатов:
1.Амплификатор
Стандартный (для классической ПЦР с последующей визуализацией в геле);
Real-Time с оптической системой регистрации флуоресценции (для проведения ПЦР-РВ);
2.Холодовая установка
Для хранения мастер-микса до начала амплификации;
3.Система для гель-электрофореза (для классической ПЦР);
Заливочный столик;
Горизонтальная камера для электрофореза;
Источник питания;
4.Трансиллюминатор или система гель-документации
5.Спектрофотометр (опционально)
Для оценки концентрации и/или чистоты нуклеиновых кислот, например, NanoDrop.
35
Точный перечень оборудования может варьироваться в зависимости от:
Выбранной методики выделения НК;
Типа биологического материала;
Цели исследования (качественный или количественный ана-
лиз);
Формата проведения амплификации (классическая ПЦР или ПЦР-РВ).
36
Глоссарий
Амплификация – процесс многократного удвоения специфического участка ДНК (ампликона) во время ПЦР.
Амплификон (ампликон) – амплифицированный (умноженный) участок ДНК, получаемый в результате ПЦР.
Гаситель – молекула, подавляющая флуоресценцию флуорофора до момента разделения (например, при расщеплении зонда).
Гибридизация – процесс комплементарного соединения двух цепей нуклеиновых кислот (например, праймера с матрицей).
Детергенты – вещества, разрушающие клеточные мембраны (например, SDS, Triton X-100), применяемые для лизиса.
Димеры праймеров – неспецифические продукты, образующиеся при комплементарном связывании праймеров друг с другом.
ДНК-полимераза – фермент, катализирующий синтез ДНК. В ПЦР используются термостабильные формы.
Интеркалирующие красители – вещества, неспецифически связывающиеся с двуцепочечной ДНК и флуоресцирующие при связывании.
Контаминация – загрязнение реакций чужеродной нуклеиновой кислотой. Требует строгого соблюдения зональности и стерильности.
Контрольный образец – образец, используемый для проверки корректности реакции.
Кривая плавления – график изменения флуоресценции при нагревании, используемый для оценки специфичности продукта ПЦР.
Матрица – нуклеиновая кислота, которая служит исходной последовательностью для синтеза комплементарной цепи в ПЦР.
Молекулярные маяки – особый тип зондов, принимающих шпилечную структуру с флуорофором и гасителем, которые расходятся при гибридизации с матрицей.
37
Перекрѐстная контаминация – попадание амплифицированного продукта в другие образцы, приводящее к ложноположительным результатам.
Плато – стадия ПЦР, на которой прекращается экспоненциальное увеличение ампликона.
Пороговый цикл (Ct, Cycle threshold) – номер цикла, при ко-
тором флуоресцентный сигнал в ПЦР в реальном времени пересекает порог и становится детектируемым.
Праймер – короткий одноцепочечный олигонуклеотид, комплементарный фланкирующему участку матрицы, необходимый для начала синтеза новой цепи
Референсный ген – стабильный в экспрессии ген, используемый для нормализации данных в количественной ПЦР.
Самокомплементарность – наличие участков в праймерах, способных образовывать внутримолекулярные связи, что может вызывать шпильки и снижать эффективность ПЦР.
Спейсер – участок между флуорофором и гасителем в зонде, обеспечивающий его правильную пространственную конфигурацию.
Таутометрия – явление изменения положения водорода в азотистых основаниях, потенциально приводящее к ошибкам спаривания оснований.
Флуорофор – молекула, испускающая флуоресценцию, используемая для визуализации амплификации.
Флуорохромы – обобщѐнное название для флуоресцентных молекул, применяемых в биологических исследованиях.
Фланкирующая последовательность – любая нуклеотидная последовательность, расположенная рядом («по соседству», «на фланге») с другой последовательностью
Эффективность амплификации – показатель того, насколько близко амплификация к идеальному удвоению (100 %) в каждом цикле. Нормой считается диапазон 90-110 %.
38
Список литературы
1.Баранова Е.Е., Гнетецкая В.А., Беленикин М.С. Неинвазивное определение пола и резус-фактора плода методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. – М.: ФГБОУ ДПО РМАНПО, 2018. – 56 с.
2.Зорина В.В. Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР): методическое пособие. – М.: ДНК-технология, 2012. – 80 с.
3.Коломыткин О.В. Биофизические принципы метода полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR): учебное пособие. – СПб.: Наукоемкие технологии, 2024. – 24 с.
4.Ребиков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др. ПЦР в реальном времени / под ред. д.б.н. Д.В. Ребикова. – 12-е изд. – М.: Лаборатория знаний, 2024. – 223с.
5.Azqueta A., Slyskova J., Langie S.A. and etl. Comet assay to measure DNA repair: approach and applications / Frontiers in Genetics. – 2014. – V.5. – №.288.
39
Алексей Алексеевич Афонин
Людмила Николаевна Комарова
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Учебно-методическое пособие
Часть 1. Теоретические основы ПЦР
В двух частях
Оригинал-макет подготовил А.А. Афонин
Подписано в печать 02.07.2025. Формат 60х84 1/16 Уч.-изд.л. 2,5. П.л. 2,5. Изд. № 025-1.
Обнинский институт атомной энергетики НИЯУ МИФИ. 249039, г. Обнинск Калужской обл., квартал Студенческий городок, 1.