Генетическая токсикология. Учебное пособие

8.Что такое GLP?

9.Почему методы учета мутаций называют тест-системами?

10.Какие типы мутаций регистрируют тест-штаммысалмонеллы.

11.Как учитывают реципрокные транслокации?

12.Что такое кластоген?

13.Как изучают способность химических соединений индуцировать мутации в половых клетках мышей?

14.Как изучают мутагенную активность химических соединений в соматических клетках мышей?

Вопросы для самостоятельной работы

1.Доминантный летальный тест на мышах.

2.Метод специфических локусов: принципы и применение.

52

Глава 7. МУТАГЕНЕЗ И КАНЦЕРОГЕНЕЗ

Современные представления о причинах злокачественной трансформации клеток – превращение их в раковые – основано на двух группах фактов. Первая группа факторов – существование онкогенных вирусов, или ретровирусов, содержащих РНК в качестве генетического материала, ДНКкопии которых могут встраиваться в геном инфицируемой клетки. Результатом этого процесса может быть злокачественное новообразование. Онкогенные вирусы содержат онкоген, экспрессия которого и ответственна за канцерогенез. Этот механизм восходит к вирусо-генетической теории рака, предложенной в 1945 г. советским ученым Л. А. Зильбером.

Вторая группа фактов сводится к тому, что разнообразные внешние воздействия на клетки, в большинстве случаев (но не всегда) мутагенные, также могут привести к их превращению в раковые. Наследственные заболевания человека, связанные с нарушениями репарации, сопровождаются повышением мутабильности соматических клеток, судя по хромосомным аберрациям, и тоже характеризуются повышенной частотой злокачественных новообразований. Предположения о мутационной природе канцерогенеза высказываются с начала XX в., начиная с работы Т. Бовери (1914).

Таким образом, первая группа фактов побуждает искать причину рака в действии генетического материала, вносимого в клетку извне, а вторая – искать генетические причины рака в самой клетке. Эти подходы объединяют сведения о том, что в нормальных клетках существуют так называемые протоонкогены – гены, гомологичные онкогенам ретровирусов. Протоонкогены чрезвычайно консервативны и сходны в геномах человека, мыши, дрозофилы и даже дрожжей. Некоторые из них контролируют нормальное протекание клеточного цикла. Нельзя сказать, что механизм канцерогенеза выяснен, однако наиболее вероятной причиной представляется злокачественная трансформация клетки вследствие нарушения экспрессии некоторых ее генов (онкогенов, протоонкогенов) в результате мутационных или модификаци-онных изменений, а также в результате вирусной инфекции.

Всвете этих представлений распространение в окружающей среде генетически активных агентов может приводить не только к повышению частоты мутаций, но и к повышению частоты злокачественных новообразований.

Всвязи с этим программы тестирования химических соединений различных физических и биологических факторов предусматривают выявление среди них потенциальных канцерогенов. Учитывая важность этой задачи, в международном масштабе разрабатываются чувствительные тест-системы выявления канцерогенов, координируемые Всемирной организацией здравоохранения и другими международными организациями.

53

В частности, для выявления канцерогенов используются кратковременные тесты, дополненные прямым испытанием химических соединений на их способность вызывать злокачественную трансформацию в культурах клеток животных и человека, а также у животных (мыши, крысы, хомяки). При высоком уровне корреляции (до 90 %) мутагенных и канцерогенных свойств химических препаратов определенные трудности возникают в связи с тем, что некоторые канцерогены генетически неактивны, а некоторые активные мутагены не являются канцерогенами

Дальнейшее совершенствование систем тестирования мутагенов и канцерогенов должно способствовать не только обеспечению безопасности человека, но и пониманию механизмов канцерогенеза (Инге-Вечтомов,1989).

Рак – это генетическая болезнь, при которой клетки начинают бесконтрольно размножаться. При размножении большого количества раковых клеток нормальные клетки вытесняются или повреждаются.

Установлено, что рак является результатом множественных мутаций, в результате которых в нормальных клетках происходят три основных изменения.

1.Трансформации. У раковых клеток не наблюдаются нормальные ограничения роста и деления.

2.Иммортализация. Раковые клетки продолжают делиться бесконечно, в отличие от нормальных клеток, которые делятся определенное количество раз (около 50 раз), а затем прекращают деление и погибают.

3.Метастазирование. Раковые клетки приобретают способность метастазировать, то есть двигаться с места образования и вторгаться в другие ткани.

Первой ступенью на пути к раку является опухоль (неоплазма) – бесконтрольно растущая популяция клеток. Однако опухоль считается доброкачественной до тех пор, пока не приобретает способности образовывать метастазы. В этом случае опухоль считается злокачественным и угрожает жизни.

Процесс превращении нормальной клетки в раковую называется онкогенезом, а наука, посвященная изучению рака, – онкологией (Канцерогенез, 2004).

К пониманию генетической природы рака привели исследования, проведенные в 70-х годах, вируса, который был открыт у больных цыплят Френсисом Раусом еще в начале ХХ века и получивший название вирус саркомы Рауса. Было показано, что вирус саркомы Рауса и другие вирусы, вызывающие рак в качестве генетического материала несут РНК, а не ДНК. Они также продуцируют фермент, обратную транскриптазу, которая транскрибирует вирусную РНК в ДНК. ДНК эта затем встраивается в ДНК клетки. Целью вируса, как и всех остальных вирусов, является завладение клеточным аппаратом, чтобы превратить его в фабрику, производящую вирус. В ходе этого процесса некоторые клетки вирус превращал в раковые. Был выделен вариант вируса саркомы Рауса, который не вызывал рак. У этого варианта вируса отсутствовал большой по размерам ген, расположенный в конце генома, ко-

54

торый имелся у вызывавшего рак вируса. Ген получил название src, по имени саркомы. В дальнейшем ген src был обнаружен в ДНК цыплят, он был активен, хотя клетки цыплят и не были раковыми. Ген src, или очень похожий на него, имел невирусное происхождение. Позже ген src был обнаружен у рыб, птиц, млекопитающих и человека. Это указывало на то, что этот ген имеет какую-то важную клеточную функцию. Однако в некоторых случаях изменения в этом гене превращает его в онкоген. С тех пор были открыты многие онкогены, являвшиеся измененными формами нормальных клеточных генов. В настоящее время варианты онкогенов, не вызывающие рак называют протоонкогенами.

Протоонкогены и антионкогены (онкосупрессоры)

Как и любые другие гены, протоонкоген несет инструкцию для синтеза белка. Протоонкоген src производит белок киназа, который фосфорилирует некоторые аминокислоты в белках. Фосфорилирование является нормальной функцией клетки и оно требуется для активности некоторых белков, особенно во время клеточного роста. В норме киназы вступают в дело, только когда получают сигналы от других компонентов клетки. Онкогены, продуцирующие киназы, делают это беспрерывно.

Другие протоонкогены также выполняют важные функции, изменение которых приводит к возникновению рака. Некоторые из них производят факторы роста, заставляющие клетку расти и размножаться, а другие продуцируют рецепторы, белки, с которыми связываются вещества, усиливающие рост клетки. Эти белки, в свою очередь, посылают сигналы активировать продукцию дополнительных веществ, требуемых для роста клетки. Онкогенные варианты всех указанных протоонкогенов продолжают усиливать рост клетки, в то время как они должны были бы его прекращать.

Для превращения протоонкогена в онкоген достаточна одна точковая мутация. Например, онкоген ras из опухоли мочевого пузыря человека отличается от своего протоонкогена всего одной парой оснований – замена в 12-м кодоне глицина на любую аминокислоту, за исключением пролина, приводит к появлению у гена трансформирующей способности. К онкогенной активации также приводит замена глутамина в положении 61 на любую аминокислоту, кроме пролина и глутаминовой кислоты.

Гены семейства ras представляют собой группу протоонкогенов, наиболее часто активирующихся при опухолевом перерождении клеток. Мутации одного из генов HRAS, KRAS2 или NRAS обнаруживают примерно в 15 % случаев злокачественных новообразований у человека. У 30 % клеток аденокарцином лёгкого и у 80 % клеток опухолей поджелудочной железы обнаруживается мутация в онкогене ras, что ассоциируется с плохим прогнозом протекания заболевания.

55

Некоторые онкогены начинают вызывать рак, когда перемещаются с одной хромосомы на другую или меняют положение на своей хромосоме. Превращение протоонкогена в онкоген – это пример мутации с приобретением функции: нормальный ген начинает функционировать так, как не должен, и провоцирует безудержный рост клеток. Но мутации с потерей функции также могут вызвать рак. В 80–90-х годах XX века были обнаружены клеточные гены, осуществляющие негативный контроль клеточной пролиферации, то есть препятствующие вступлению клеток в деление и выходу из дифференцированного состояния. Утрата функции этих генов вызывает неконтролируемую клеточную пролиферацию. Благодаря своему противоположному по отношению к онкогенам функциональному назначению они были названы антионкогенами или генами-супрессорами злокачественности. В отличие от онкогенов, мутантные аллели генов-супрессоров рецессивны. Отсутствие одного из них, при условии, что второй нормален, не приводит к снятию ингибирования образования опухоли. Если гены – онкосупрессоры (антионкогены) выключаются, то бесконтрольный рост клеток начинается так же эффективно, как при функционировании онкогенов, усиливающих клеточный рост.

Первый супрессор опухоли был обнаружен в редком типе опухоли, ретинобластоме. Она поражает сетчатку глаза у детей. Болезнь иногда передается по наследству, а иногда возникает спонтанно. В 1971 году Альфред Г. Кнудсон предположил, что дети, у которых развивалась наследственная ретинобластома, должно быть, наследовали две дефектные копии гена. Одна мутировавшая копия была наследована, а вторая изменилась из-за случайной мутации. Такая мутация могла произойти и до рождения, когда клетки глаза размножаются очень быстро.

В редких случаях, когда ребенок родился с двумя нормальными копиями генов, мутации могли произойти в обеих, повредив их и вызвав болезнь. Генетическая причина болезни всегда одна – повреждение двух генов, а вот процесс повреждения может быть различным.

При исследовании генетических основ ретинобластомы было обнаружено, что у детей с наследственной ретинобластомой часть хромосомы 13 отсутствует во всех клетках организма детей. Однако у детей с ненаследственной формой опухоли она отсутствовала только в клетках опухоли. В 1986 году была определена последовательность ДНK хромосомы, которой не было в ретинобластоме, ген был маркирован как Rb, по названию ретинобластомы.

Ген Rb с тех пор был найден и в других тканях и связан с другими формами рака. Но это не единственный супрессор опухоли. Были обнаружены и другие супрессоры. Один из самых важных и общий для многих типов рака (включая рак толстой кишки, мочевого пузыря и молочной железы) – это ген р53. Он связан с половиной всех раковых опухолей. Требуется повредить обе копии гена Rb, чтобы сделать неактивной супрессию роста клетки,

56

но тот же эффект достигается повреждением всего одной копии гена р53. Однако это необязательно приводит к мгновенному развитию рака. Обычно развитие рака требует более одного изменения в генах.

Протоонкогены и гены-супрессоры образуют сложную систему пози- тивно-негативного контроля клеточной пролиферации и дифференцировки, а злокачественная трансформация реализуется через нарушение этой системы.

Известно около сотни протоонкогенов. Повреждения некоторых из них, приводящие к превращению в онкогены, встречаются во множестве опухолей (Канцерогенез, 2004; Худолей, 1993).

Многостадийная природа канцерогенеза. В 1971 году Альфред Кнуд-

сон, основываясь на данных статистического анализа проявления разных форм ретинобластомы, предположил, 2-х ударную модель канцерогенеза, согласно которой для перехода нормальной клетки в опухолевую необходимо два мутационных события («удара»). Первым событием является мутация, приводящая к образованию клетки, для которой повышен риск возникновения опухоли. Такие мутации могут возникать как в соматических, так и в половых клетках. Вторым событием, происходящем в соматической клетке, является мутация в неповрежденном аллеле гена и превращение клетки с повышенным риском трансформации в опухолевую, которая начинает безостановочно делиться, что приводит к возникновению злокачественного новообразования.

При наследственной форме ретинобластомы первая мутация происходит в половой клетке одного из родителей, и для образования опухоли требуется еще одна мутация в соматической клетке. При ненаследственной форме должны возникнуть две мутации, причем в одной и той же соматической клетке. Совпадение двух независимых мутаций в одной клетке является редким событием, и поэтому спорадическая ретинобластома как результат двух соматических мутаций наблюдается в более зрелом возрасте.

В дальнейшем гипотеза была подтверждена исследованиями, которые показали, что в ряде случаев в опухолях наблюдается гомозиготность по некоторым маркерам, в то время как в крови по этим же маркерам отмечалась гетерозиготность. То есть в опухоли наблюдается потеря гетерозиготности, которая может быть вызвана делецией участка или полной потерей хромосомы. Примером могут служить случаи потери гетерозиготности локуса 11р15 при нефробластоме, локуса 9р21 в случае меланомы, локуса 1р36 при нейробластоме и локуса 8р21–12 при раке простаты.

По современным представлениям, для процессинга трансформированных клеток в злокачественную опухоль требуются от трёх до шести дополнительных генетических повреждений. Данные эпидемиологических, клинических, экспериментальных и молекулярно-генетических исследований хорошо согласуются с этими представлениями.

57

Мутаторный фенотип. Встречаемость рака у человека значительно выше теоретически ожидаемой, если исходить из предположения о независимом и случайном возникновении мутаций в опухолевой клетке. Для объяснения этого противоречия выдвинуто предположение о том, что ранним событием канцерогенеза является изменение нормальной клетки, ведущее к резкому повышению частоты мутаций, то есть возникновению мутаторного фенотипа.

Клетки с дефектом системы пострепликативной репарации характеризуются повышением частоты спонтанных мутаций. Степень мутаторного эффекта варьирует от двукратного повышения мутабельности до шестидесятикратного. Мутаторный фенотип способствует появлению серии вторичных мутаций в различных генах и микросателлитной нестабильности. Последняя является индикатором мутаторного фенотипа и диагностическим признаком дефекта пострепликативной репарации.

В результате дефекта пострепликативной репарации происходит накопление мутаций в генах критических точек, что является предпосылкой клеточной прогрессии к полному озлокачествлению. Инактивация рецепторной системы, обусловленная мутацией сдвига рамки считывания в повторах кодирующей последовательности, наблюдается только в опухолевых клетках и не обнаруживается без микросателлитной нестабильности.

Канцерогенез вследствие дефицита пострепликативной репарации протекает, по крайней мере, в три этапа.

1.Создание соматического «промутаторного» фенотипа гетерозиготной мутацией генов пострепликативной репарации.

2.Потеря аллеля дикого типа продуцирует соматический мутаторный фенотип.

3.Потеря контроля роста и создание ракового фенотипа последующей мутацией (в онкогенах и генах-супрессорах опухолей)

Канцерогены. Канцерогены – это факторы внешней среды, которые превращают нормальные клетки в раковые. Примерами канцерогенов могут служить различные химические вещества, ионизирующая радиация и вирусы. Почти все мутагенные химические соединения проявляют канцерогенную активность. Есть и негенотоксичные канцерогены.

Требуются, по крайней мере, две ступени, чтобы вредоносное действие канцерогенов увенчалось успехом.

1.Инициация. Начальная мутация, возникающая после первого контакта клетки с канцерогеном. Она подготавливает клетку к раковому перерождению, но еще не вызывает рака.

2.Промоция (подкрепление). Включает повторное действие канцерогена или различных канцерогенов (или даже веществ, которые не считаются канцерогенами), называемых промоторами. Промоторы вызывают необходи-

58

мое количество мутаций, которые превращают клетку в раковую. Это процесс постепенный, он может неделями длиться у лабораторных крыс и годами у людей.

Таким образом, за первой мутацией должны последовать повторные мутации и другие изменения, прежде чем разовьется рак. Рак прямой кишки, например, развивается только после активации одного онкогена и повреждения трех генов супрессоров роста клеток, включая р53. Вот почему этот рак развивается годами и чаще случается у пожилых людей (Канцерогенез, 2004; Худолей, 1993).

Для активации некоторых канцерогенных химических соединений требуется биотрансформация их в генотоксичное соединение в организме. Такие соединения называются проканцерогенами, метаболическая активация которых обычно осуществляется ферментами в различных тканях, особенно в печени. Причиной того, что отдельные вещества могут вызывать рак у одних видов организмов, а у других не вызывают, является отсутствие у некоторых видов ферментов, превращающих неактивные проканцерогены в активные канцерогены (Бочков, Чеботарев, 1989).

Тематика рефератов

1.Генетический мониторинг окружающей среды.

2.Методы генетического мониторинга окружающей среды.

3.Генетический мониторинг природных популяций.

Контрольные вопросы и задания

1.Что такое генетический мониторинг?

2.Какие виды генетического мониторинга существуют?

3.Как анализируется мутагенная активности загрязнителей воздуха?

4.Как анализируется мутагенная активность загрязнителей воды?

5.Как анализируется мутагенная активность воздуха промышленных помещений?

6.Что означает генетический мониторинг человеческих популяций?

7.Что такое генетический груз?

8.Какие методы используются для мониторинга человеческих популяций?

9.Что дает учет врожденных пороков развития?

10.Какую информацию можно получить при проведении биохимического мониторинга и цитогенетический мониторинга?

Вопросы для самостоятельной работы

1.Генетический мониторинг человеческой популяции: цели и методы.

2.Генетический груз и мутационный процесс.

59

Глава 8. АНТИМУТАГЕННАЯ ЗАЩИТА ГЕНОМА

Все мероприятия по выявлению генетически активных факторов направлены на сведение к минимуму контактов человека с мутагенами. В тех случаях, когда человек вынужден с ними соприкасаться, необходимо иметь в резерве средства минимизации риска мутационных и канцерогенных изменений. Для этого необходимо знать пути мутагенеза и уметь вмешиваться в этот процесс. Становление мутаций – процесс многоэтапный. В упрощенном виде его можно представить в виде схемы (рис. 5).

Рис. 5. Последовательные этапы возникновения и появления мутаций (Инге-Вечтомов, 1989)

Многие мутагены, попадая в организм, включаются в цепи метаболических превращений и затем могут активироваться, т.е. приобрести или повысить свою генетическую активность, так и инактивироваться, т.е. потерять ее. Оказываясь внутри клетки, мутаген взаимодействует с генетическим ма-

60