Генетическая токсикология. Учебное пособие

хромосомных аберраций, таких как делеции (в том числе и микроделеции), транслокации, удвоение и анэуплоидия. FISH на интерфазных хромосомах служит быстрым методом пренатальной диагностики трисомий по 21, 18 или 13 хромосомам или аберраций половых хромосом. FISH является чувствительным методом для идентификации хромосомных аберраций и одномоментного быстрого анализа большого (>500) числа клеток. Метод обладает высокой точностью при идентификации природы хромосом и неизвестных фрагментов хромосомной ДНК (Бочков, Катосова, Титенко, Филиппова, 1991).

2.2.3. Геномные мутации

Изменение числа хромосом в клетке означает изменение генома. Такие изменения называют геномными мутациями. Известны различные цитогенетические феномены, связанные с изменением числа хромосом (ИнгеВечтомов, 2010).

Автополиплоидия. Автополиплоидия представляет собой многократное повторение генома одного и того же вида или основного числа хромосом (х). Этот тип полиплоидии характерен для низших эукариот и покрытосеменных растений. У многоклеточных животных автополиплоидия встречается крайне редко: у дождевых червей, некоторых насекомых, некоторых рыб и земноводных. Автополиплоиды у высших позвоночных животных не встречается, они погибают на ранних стадиях внутриутробного развития.

У большинства эукариотических организмов основное число хромосом (x) совпадает с гаплоидным набором хромосом (n); при этом гаплоидное число хромосом – это число хромосом в клетках, образовавшихся в ходе мейоза. Тогда в диплоидных (2n) содержится два генома x, и 2n=2x. Однако у многих низших эукариот, многих споровых и покрытосеменных растений в диплоидных клетках содержится не 2 генома, а некоторое иное число. Число геномов в диплоидных клетках называется геномным числом. Последовательность геномных чисел называется полиплоидным рядом.

Различают сбалансированные и несбалансированные автополиплоиды.

Сбалансированными полиплоидами называются полиплоиды с чётным числом хромосомных наборов, а несбалансированными – полиплоиды с нечетным числом хромосомных наборов.

Автополиплоидия часто сопровождается увеличением размеров клеток, пыльцевых зерен и общих размеров организмов, повышенным содержанием сахаров и витаминов. Среди культурных растений широко распространены как триплоиды (ряд сортов земляники, яблони, арбузов, бананов, чая, сахарной свеклы), так и тетраплоиды (ряд сортов ржи, клевера, винограда). В природных условиях автополиплоидные растения обычно встречаются в экстремальных условиях (в высоких широтах, в высокогорьях); более того, здесь они могут вытеснять нормальные диплоидные формы.

21

Положительные эффекты полиплоидии связаны с увеличением числа копий одного и того же гена в клетках, и, соответственно, в увеличении дозы (концентрации) ферментов. Однако автополиплоиды (особенно несбалансированные) характеризуются сниженной плодовитостью или полным бесплодием, что связано с нарушениями мейоза. Поэтому многие из них способны только к размножению вегетативным путем.

Аллополиплоидия. Полиплоиды, полученные в результате отдаленной гибридизации, то есть от скрещивания организмов, принадлежащих к различным видам, и содержащие два и более набора разных хромосом, называ-

ются аллополиплоиды.

Аллополиплоиды широко распространены среди культурных растений. Однако если в соматических клетках содержится по одному геному от разных видов (например, один геном А и один – В), то такой аллополиплоид

– бесплоден. Бесплодие простых межвидовых гибридов связано с тем, что каждая хромосома представлена одним гомологом, и образование бивалентов в мейозе оказывается невозможным. Таким образом, при отдаленной гибридизации возникает мейотический фильтр, препятствующий передаче наследственных задатков в последующие поколения половым путем. Поэтому, у плодовитых полиплоидов каждый геном должен быть удвоен. Например, у разных видов пшеницы гаплоидное число хромосом (n) равно 7. Дикая пшеница (однозернянка) содержит в соматических клетках 14 хромосом лишь одного удвоенного генома А и имеет геномную формулу 2n = 14 (14А).

Возможность преодоления бесплодия при отдаленных гибридизациях была показано в опытах Г.Д. Карпеченко, который сумел создать капустноредечный межродовой, плодовитый гибрид (Raphano-Brassica). В процессе мейоза у простого бесплодного капустно-редечного гибрида образуются женские и мужские гаметы с разным числом хромосом. В очень редких случаях в пыльца или семезачатки может попасть полный набор (9R+9В) хромосом и при оплодотворении образуется аллотетраплоид, в клетках которого каждая хромосома представлена парой гомологов, что обеспечивает нормальное образование бивалентов и нормальное расхождение хромосом в мейозе: 18 R + 18 B → (9 R + 9 B) и (9 R + 9 B).

Анеуплоидия. Анеуплоидия (гетерополиплоидия) – это изменение числа хромосом в клетках, некратное основному хромосомному числу. Различают несколько типов анеуплоидии. При моносомии утрачивается одна из хромосом диплоидного набора (2n – 1). При полисомии к кариотипу добавляется одна или несколько хромосом. Частным случаем полисомии является трисомия (2n + 1), когда вместо двух гомологов их становится три. При нуллисомии отсутствуют оба гомолога какой-либо пары хромосом (2n – 2). У человека анеуплоидия приводит к развитию тяжелых наследственных заболеваний. Часть из них связана с изменением числа половых хромосом (Альбертс, Брей, Льюис, 1993; Инге-Вечтомов, 2010).

22

Примеры заболеваний, вызванных анеуплоидией

Трисомия по 21-й хромосоме (генотип 47, +21); синдром Дауна; частота среди новорожденных – 1:700.

Трисомия по 13-й хромосоме (генотип 47, +13); синдром Патау. Частота среди новорожденных – 1:5.000.

Трисомия по 18-й хромосоме (генотип 47, +18); синдром Эдвардса. Частота среди новорожденных – 1:10.000 (Горбунова, Баранов, 1997).

Гаплоидия. Уменьшение числа хромосом в соматических клетках до основного числа называется гаплоидия. Существуют организмы – гаплобионты, для которых гаплоидия – это нормальное состояние (многие низшие эукариоты, гаметофиты высших растений, самцы перепончатокрылых насекомых). Гаплоидия как аномальное явление встречается среди спорофитов высших растений: у томата, табака, льна, дурмана, некоторых злаков. Гаплоидные растения отличаются пониженной жизнеспособностью; они практически бесплодны.

Механизмы возникновения полиплоидии. Автополиплоидия является следствием нерасхождения хромосом при делении клетки: при митозе (митотические полиплоиды) или при мейозе (мейотические полиплоиды). Нарушения нормального расхождения хромосом называют еще нарушением сегрегации хромосом.

Митотические полиплоиды обычно возникают вследствие нерасхождения хромосом в анафазе: вместо двух ядер образуется одно, в котором число хромосом становится в два раза большим, чем в исходном ядре. Таким образом, из диплоидной клетки (2n, или 2х) образуется тетраплоидная (4n, или 4х). У низших эукариот при дальнейших делениях клеток число хромосом может возрастать, и одно ядро может содержать множество хромосомных наборов (8х...16х...32х; и даже до 4000...6000х, например, в макронуклеусе у инфузорий).

Причины нерасхождения хромосом многообразны. Например, существует спонтанная полиплоидизация, которая происходит без видимых причин. В экспериментальных условиях нерасхождение хромосом можно вызвать путем воздействия на клетки митозными ядами, разрушающими микротрубочки веретена деления, что делает невозможным нормальное расхождение хромосом (такой митоз называется К–митозом). К митозным ядам относятся: колхицин, винбластин, аценафтен и др (Инге-Вечтомов, 2010).

Мейотические полиплоиды возникают вследствие нерасхождения хромосом при мейозе. Нерасхождение хромосом может быть спонтанным, но может быть обусловлено и действием определенных внешних факторов, как при митозе (Шевченко, Померанцева, 1985).

23

Тематика рефератов

1.Доказательства спонтанной природы мутаций у микроорганизмов.

2.Динамические мутации и их последствия.

3.Генные мутации, типы и причины их возникновения.

4.Методы выявления генных мутаций.

5.Особенности структурных генных мутаций.

6.Метод селективных сред для отбора мутантов у микроорганизмов.

7.Механизмы возникновения точковых мутаций.

8.Хромосомные аберрации и механизмы из возникновения.

9.Транслокации и обнаружение их в мейотических клетках.

10.Инверсии и обнаружение их в мейотических клетках.

11.Транспозиции и инсерционный мутагенез.

12.Метод-FISH в цитогенетических исследованиях.

13.Отделенные гибриды и методы их получения.

14.Болезни человека, вызванные ануеплоидией.

15.Механизмы возникновения полиплоидии.

16.Полиплоидные растения в природе.

17.Автополиплоиды в природе.

Контрольные вопросы и задания

1.По какой причине точечную мутацию типа замены пурина на пурин или пиримидина на пиримидин называют транзицией, тогда как замену типа пурин на пиримидин (или наоборот) называют трансверсией?

2.Каково ожидаемое отношение числа транзиций к числу трансверсий при большом количестве мутаций?

3.Почему увеличение числа тринуклеотидных повторов приводит к развитию болезни? Почему такие изменения в ДНК называются динамическими мутациями?

4.Какие типы генных мутаций у бактериофага могут ревертировать под действием диаминоакридина?

5.Что такое нонсенс-мутация и амбер-мутация?

6.Какие известны методы учета генных мутаций у дрозофилы, у мышей и у микроорганизмов?

7.Чем отличаются обратные мутации и реверсии?

8.Какие принципиальные вопросы в теории мутаций у бактерий были разрешены с помощью метода реплик?

9.Нарисуйте схему скользящей репликации, приводящей к увеличению числа тринуклеотидных повторов.

10.Что такое внутригенная супрессия?

11.Что такое вариации числа копий? Как они возникают?

12.Чем отличается метод селективных сред и метода генетического

анализа?

24

13.Какие таутомерные формы оснований ДНК знаете?

14.Чем отличаются структурные генные мутации от точковых генных

мутаций?

15.В каких случаях мутация может оказать плейотропное действие?

16.Дайте определение термину «мутация». Какая категория наследственных изменений получила название естественных мутаций?

17.Назовите причины динамических мутаций. Приведите примеры сходных мутаций у животных.

18.Какие признаки организма затрагиваются при мутациях генов?

19.Что такое структурные изменения хромосом?

20.Дайте классификацию основных типов мутаций. Что такое частота

мутаций?

21.Что такое прямое и обратное мутирование, инсерционный мутагенез?

22.Чем отличаются соматические мутации от генеративных мутаций?

23.Как наследуются Х-сцепленные рецессивные мутации?

24.Приведите примеры множественного аллелизма.

25.Дайте описание на примере дрозофилы генетического метода обнаружения транслокаций.

26.Как изменяется структура хромосом при возникновении инверсий?

Вчем различие парацентрических и перицентрических инверсий?

27.Каковы последствия кроссинговера при его прохождении у гетерозигот в области инверсий?

28.Как выглядит картина конъюгации в мейозе двух гомологичных хромосом (обозначения генов в хромосомах произвольные), если одна из них утратила три гена примерно в середине хромосомы?

29.Как можно объяснить образование в анафазе I мейоза моста и фрагмента?

30.Как среди зигот появляются моносомики?

31.Почему резко повышается фертильность при удвоении числа хромосом у межвидовых гибридов?

32.Напишите формулу плодовитого гибрида, если геном К одного вида имеет n = 20, а геном Р другого вида – n = 10.

33.Как объяснить присутствие унивалентов в мейозе у гибридной формы? На какой стадии мейоза их обнаруживают?

34.Как возникают митотические полиплоиды?

Вопросы для самостоятельной работы

1.Основные положения мутационной теории Г. Де Фриза.

2.Механизмы образования хромосомных аберраций.

3.Закон гомологических рядов в наследственной изменчивости Н.И. Вавилова.

4.Множественный аллелизм и его генетические основы.

5.Опыты Г. Де Фриза и его основные выводы.

25

Глава 3. ФАКТОРЫ, ВЫЗЫВАЮЩИЕ МУТАЦИИ

3.1. Механизмы мутагенного действия радиации

Радиация (от лат. Radius – луч) является физическим фактором, в условиях которого возникла и продолжает существовать жизнь на Земле. К радиации относятся все виды излучения: радиоволны, инфракрасное излучение, видимый свет, ультрафиолет и ионизирующее излучение. Все они имеют электромагнитную природу и различаются длиной волны.

Ионизирующие излучения

В обычном понимании радиация – это ионизирующее излучение, обладающее способностью ионизировать атомы и молекулы на всем пути проникновения (пробега). По своей природе ионизирующее излучение делят на 2 вида:

1) потоки частиц, образующиеся при ядерных превращениях (радиоактивного распада), наиболее важные из них:

-частиц – тяжелые частицы, состоящих из нейтронов и протонов; -частицы – быстрые электроны от U 238 или Ra.

2) электромагнитные излучения: -частицы – гамма-лучи (гамма-кванты);

рентгеновские лучи – электромагнитное излучение, испускаемое при торможении электронов, и не имеет отношения к радиоактивному распаду, в отличие от -частиц.

Ионизирующие излучения обладают различной проникающей способностью в зависимости от вида и энергии этого излучения, а также плотности вещества или тканей, на которые оно воздействует. Отсюда и термин «проникающее излучение» как синоним термина «радиация».

Источники облучения. Источниками облучения являются естественный радиационный фон земли и искусственный радиационный фон. Естественный радиационный фон представляет собой ионизирующие излучения природных источников космического и земного происхождения. Космические излучения представляют собой поток ядерных частиц, приходящих из различных областей мирового пространства.

Земная радиация обусловлена естественными радионуклидами, которые содержатся в земной коре, и при распаде которых образуется большое количество радиоизотопов. Из всех естественных источников радиации наибольшую опасность представляет радон – невидимый тяжелый газ без вкуса и запаха. Искусственный радиационный фон земли обусловлен в основном продуктами ядерного деления урана и плутония при испытаниях ядерного оружия и выбросами радионуклидов АЭС, промышленными и энергетическими реакторами (Кудряшов, 2004; Шевченко, Померанцева, 1985).

Механизмы биологического действия. В основе биологического дей-

ствия ионизирующего излучения лежит ионизация и возбуждения атомов и молекул в органах и тканях человека. Возникшие радикалы взаимодействуют

26

с растворенными в организме различными соединениями и дают начало вторичным радикалам. Продукты этих реакций вступают во взаимодействия с органическими молекулами клеток.

Повреждение ДНК идет двумя путями: непосредственное попадание ионизирующей частицы в молекулу и косвенно через индукцию свободных радикалов. При этом индуцируются модификации оснований, сшивки ДНКДНК и ДНК-белок, а также одно- и двунитевые разрывы молекулы ДНК (Клаг, Каммингс, 2009).

Изменения свойств биологических молекул под действием радиации трансформируются в клеточные повреждения. Мутагенные и канцерогенные последствия радиации могут проявиться спустя многие годы после облуче-

ния. Поэтому их называют отдаленными последствиями.

Единицы измерения. В зависимости от того, каков размер облученного участка и где он расположен, один ли человек или группа людей принято различать следующие виды доз облучения.

Поглощенная доза – это количество энергии излучения, поглощенное единицей массы облучаемого тела (тканями организма) и измеряется в системе СИ в грэях (Гр). 1 Гр равен 1 джоулю, поглощенному 1 кг вещества

(1 Гр = 1 Дж/кг = 100 рад).

Эквивалентная доза – поглощенная доза, рассчитанная с учетом коэффициента, отражающего способность данного вида излучения повреждать ткани организма. Величина его для фотонов и электронов разной энергии равна 1, для нейтронов в зависимости от их энергий – 5-20, протонов – 5, α-частиц, осколков деления, тяжелых ядер – 20. При воздействии различных видов излучения с различными взвешивающими коэффициентами эквивалентная доза определяется как сумма эквивалентных доз для этих видов излучения. Единицей эквивалентной дозы является зиверт (Зв).

Эффективная доза – эквивалентная доза, умноженная на коэффициент, учитывающий разную чувствительность различных тканей к облучению. Такой коэффициент для половых желез равен 0,20; красных клеток костного мозга, легких, желудка, толстого кишечника – 0,12; для других органов – 0,05. Например, если поглощенная доза в щитовидной железе равна 1 Гр, то эффективная доза будет равна 5 сГр (5 бэр).

Эффективная доза используется как мера риска возникновения отдаленных последствий облучения всего тела человека и отдельных его органов и тканей с учетом их радиочувствительности. Для оценки полной эффективной эквивалентной дозы, полученной человеком, рассчитывают и суммируют указанные дозы для всех органов.

Коллективная доза – эффективная эквивалентная доза, полученная группой людей от какого-либо источника радиации, и она выражается в че- ловеко-зивертах (чел Зв).

Экспозиционная доза – мера энергии гамма-излучения, определяемая по ионизации воздуха. Системная единица – кулон на килограмм (Кл/кг). На практике чаще используется внесистемная единица измерения – 1 Рентген (Р), 1Кл/кг = 3876 Р (Зайнуллин, 1998; Кудряшов, 2004).

27

Особенности действия радиации на живые объекты. Ученые еще в

30-е годы ХХ века столкнулись с несоответствием между ничтожным количеством поглощенной клеткой энергии излучения и вызываемым им большим биологическим эффектом. При объяснении этого парадокса были сформулированы принципы попадания и мишени. В разработку этих принципов большой вклад внесли Д.Е. Ли, К.Г. Циммер и Н.В. Тимофеев-Ресовский.

Согласно принципу попадания, при ионизирующем излучении повреждающий эффект возникает по принципу «все или ничего» в зависимости от попадания или непопадания ионизирующих частиц в уникальную структуру живого объекта. Согласно принципу мишени, объем живых клеток гетерогенен по своей чувствительности: в них имеются определенные участки (мишени), попадание в которые (и только в них!) приводит к поражению объекта.

Радиационный эффект может быть обусловлен одним или несколькими попаданиями ионизирующих частиц в мишень. От этого зависит характер зависимости доза-эффект. В первых же экспериментах с дрозофилой Г. Меллер (1927) установил линейную зависимость индукции сцепленных с полом летальных мутаций от дозы рентгеновских лучей. Многочисленные эксперименты показали, что при анализе генетического действия радиации для одноударных мутаций (генные мутации, концевые разрывы хромосом), образующихся в результате одного попадания в одну мишень, наблюдается линейная зависимость.

Хроматидные и хромосомные транслокации и инверсии, появление которых связано с соединением фрагментов, возникают при двух независимых разрывах. Если каждый из разрывов возникает с некоторой вероятностью р, то вероятность совпадения двух разрывов будет равно величине р2. Это показывает, что появление обменных двуударных перестроек возрастает пропорционально квадрату дозы, то есть имеет характер экспоненциальной кривой (Кудряшов, 2004; Шевченко, Померанцева, 1985).

3.2. Действие радиации на человека

Последствия воздействия радиации на человека обычно делятся на две категории:

1.Соматические – возникающие в организме человека, подвершегося облучению. К соматическим эффектам относятся: лейкозы, опухоли разных органов, локальные лучевые поражения, лучевая болезнь.

2.Генетические – связанные с повреждением генетического аппарата и проявляющиеся в следующем или последующих поколениях: это дети, внуки

иболее отдаленные потомки человека, подвергшегося облучению (Зайнуллин, 1998; Радиация и патология, 2005).

Различают пороговые (детерминированные) и стохастические (вероятностные) эффекты.

Пороговые (детерминированные) эффекты – это клинически значи-

мые эффекты, которые проявляются в виде явной патологии.

28

При остром, кратковременном облучении могут возникать различные формы острой лучевой болезни. При облучении всего тела человека в дозе порядка 1 Гр острая лучевая болезнь не возникает и смертельные исходы исключены; при дозах 3–5 Гр в результате повреждения стволовых клеток костного мозга 50 % облученных могут погибнуть (без лечения) в течение 60 суток. При дозах 5–15 Гр вследствие желудочно-кишечного тракта возникает так называемая кишечная форма острой лучевой болезни, и гибель возможна через 10–20 суток, а при дозах свыше 15 Гр гибель облученных происходит в течение 5 суток вследствие поражения центральной нервной системы.

Стохастические (вероятностные) эффекты, такие как злокачествен-

ные новообразования, генетические нарушения, могут возникать при любых дозах облучения. С увеличением дозы повышается не тяжесть этих эффектов, а вероятность (риск) их появления. Для количественной оценки час-

тоты возможных стохастических эффектов принята гипотеза о линейной беспороговой зависимости вероятности отдаленных последствий от дозы облучения (Радиация и патология, 2005).

Научный комитет по действию атомной радиации (НКДАР) ООН и Международная комиссия по радиационной защите (МКРЗ) пришли к выводу, что доказано только два основных вида стохастических эффектов облучения:

1)мутации в соматических клетках могут быть причиной развития рака

уоблученного индивида;

2)мутации в клетках зародышевой ткани половых желез могут привести к наследуемым нарушениям у потомства облученных людей.

Исследования, охватившие примерно 100000 человек, переживших атомные бомбардировки Хиросимы и Нагасаки, показали, что рак – наиболее серьезное последствие облучения человека при малых дозах. Лейкозы стоят на первом месте. По оценочным данным, лейкозы вызывают гибель людей в среднем через 10 лет с момента облучения. Согласно оценкам НКДАР ООН, от каждой дозы облучения в 1 Гр в среднем два человека из тысячи, получивших дозы облучения в 1 Гр, умирают в дальнейшем от лейкоза (Дубинин, 2001; Зайнуллин, 1998).

Оценка генетических последствий облучения

Для изучения генетических эффектов радиации в США в 1955–1965 гг. был осуществлен проект «Грандиозная мышь». Генетические изменения учитывали по семи специфическим локусам (морфологическим) у мышей. Ко времени окончания эксперимента количество использованных животных составило почти 7 миллионов особей. Результаты этой большой работы показали:

1)различия в индивидуальной чувствительности разных особей к радиационному воздействию достигает 20-кратных значений;

2)одномоментное облучение вызывает более значительный эффект, чем та же доза, полученная через определенные периоды, то есть на протяжении времени доза не накапливается;

29

3)особи мужского пола более чувствительны к последствиям облучения, чем самки;

4)чем больше промежуток времени между временем облучения и оплодотворением, тем меньшее количество мутаций вызывает радиация у потомства.

Расчеты, проведенные экспертами НКДАР ООН, показали, что удвоение частоты спонтанных мутаций для млекопитающих находится в диапазоне поглощенной дозы 0,5–2,5 Гр. На дрозофиле величина удваивающей дозы ранее была установлена на уровне 0,05 Гр. Таким образом, в отличие от дрозофилы, данные, полученные на млекопитающих в течение почти 30-летнего эксперимента «характеризуют радиацию как слабый мутаген в отношении млекопитающих» (Зайнуллин, 1998; Радиация и патология, 2005).

Ионизирующее излучение может вызывать в половых клетках те или иные изменения, которые будут передаваться из поколения в поколение. Однако анализ этот затруднен, так как примерно 10 % всех новорожденных имеют те или иные генетические дефекты (врожденные пороки развития, дальтонизм, синдром Дауна и другие) и трудно выделить случаи, обусловленные действием радиации. Экспертные оценки НКДАР ООН показывают, что хроническое облучение в течение 30 лет суммарно в 1 Гр приводит к появлению около 2000 случаев генетических заболеваний на каждый миллион новорожденных среди детей тех, кто подвергался облучению. При этом учитывались результаты многолетних исследований возможных генетических последствий взрывов атомных бомб в Хиросиме и Нагасаки.

1. Цитологические исследования, проведенные в Японии у детей, родители которых уцелели после взрывов атомных бомб (анализировали семьи, в которых один из родителей был облучен дозой не менее 100 рад и имевшие детей, рожденных до и после взрыва, было исследовано 185 детей из 98 семей, в которых 57 детей появились до взрыва бомбы, а 128 – после), показали, что кариотипы детей оказались нормальными, за исключением трех случаев, которые были связаны с генетическими нарушениями, возникшими до взрыва.

2. Обследование 72216 детей, родители которых пережили бомбардировку, не выявило ни увеличения числа случаев врожденных дефектов, ни аномалий хромосом, ни увеличения количества раковых заболеваний по сравнению с нормой.

3. Среди более чем 27 000 детей, родители которых получили относительно большие дозы во время атомных бомбардировок Хиросимы и Нагасаки, были обнаружены лишь две вероятные мутации, а среди примерно такого же числа детей, родители которых получили меньшие дозы, не отмечено ни одного такого случая. Среди детей, родители которых были облучены в результате взрыва атомной бомбы, не было также обнаружено статистически достоверного прироста частоты хромосомных аномалий (Радиация и патоло-

гия, 2005).

30