Генетическая токсикология. Учебное пособие

Репарация ошибок репликации ДНК. Ошибки спаривания азотистых оснований во время репликации ДНК происходят достаточно часто (у бактерий один раз на 10 тыс. нуклеотидов), в результате которых в дочернюю цепь ДНК включаются некомплементарные нуклеотидам материнской цепи нуклеотиды – миссмэтчи (англ. mismatch – не соответствовать). Несмотря на то, что ДНК-полимераза I прокариот обладает способностью к самокоррекции, ее усилия по устранению ошибочно присоединенных нуклеотидов иногда оказываются недостаточны, и тогда в ДНК остаются некоторые неправильные (некомплементарные) пары. В этом случае репарация происходит с использованием определенной системы, связанной с метилированием ДНК. Действие этой системы репарации основано на том, что после репликации через определенное время (несколько минут) ДНК подвергается метилированию. У Е. coli метилируется в основном аденин с образованием N6мeтиладенина. До этого момента вновь синтезированная (дочерняя) цепь остается неметилированной. Если в такой цепи есть неспаренные нуклеотиды, то она подвергается репарации. Таким образом, метилирование метит ДНК и включает систему исправления ошибок репликации.

Рекомбинантная (пострепликативная) репарация. В тех случаях,

когда по тем или иным причинам рассмотренные системы репарации оказываются нарушенными, в цепях ДНК могут образовываться бреши (недорепарированные участки), имеющие иногда весьма существенные размеры, что чревато нарушением системы репликации и может привести к гибели клеток. В этом случае клетка в состоянии использовать для репарации одной молекулы ДНК другую, полученную после репликации молекулу ДНК, т.е. привлечь для этой цели механизм рекомбинации.

У бактерий в рекомбинантной репарации принимает участие RecА белок. Он связывается с одноцепочечным участком ДНК и вовлекает его в рекомбинацию с гомологичными участками неповрежденных цепей другой молекулы ДНК.

SOS-репарация. Механизм SOS-репарации включается тогда, когда повреждений в ДНК становится настолько много, что угрожает жизни клетки. В этом случае происходит индукция активности разнообразной группы генов, задействованных в различных клеточных процессах, сопряженных с репарацией ДНК.

Наиболее изучена SOS-репарация у Е. coli, главными участниками которой являются белки, кодируемые генами recA и lexА. Первый из них кодирует полифункциональный белок RecA, участвующий в рекомбинации ДНК, а второй – белок LexА, являющийся репрессором транскрипции большой группы генов, предназначенных для репарации ДНК бактерий. Связывание RecА-белка с белком LexА приводит к расщеплению последнего и соответственно к активации генов репарации. SOS-система репарации выявлена не только у бактерий, но и у млекопитающих (Жестяников, 1979; Тарасов, 1982).

41

Тематика рефератов

1.Эксцизионная репарация повреждений ДНК в E.coli.

2.Механизмы прямой репарации повреждений ДНК.

3.SOS-репарация и ее особенности.

Контрольные вопросы и задания

1.Что такое фотореактивация?

2.Имеется ли фотореактивация в клетках человека?

3.Как происходит исправление ошибок включения?

4.Чем отличается SOS-репарация от эксцизионной репарации?

5.Как называется фермент расщепляющий тиминовые димеры?

6.Какие типы эксцизионной репарации знаете?

8.Почему пострепликативную репарацию называют еще рекомбина-

тивной?

9.Как репарируются алкилированные основания ДНК?

10.Когда включается механизм SOS-репарации?

11.Что такое апуриновый сайт?

12.Чем отличается эксцизионная репарация оснований от репарации нуклеотидов?

13.Что означает репарация путем прямой вставки? Какой фермент ее осуществляет?

14.Приводит ли репарация повреждений ДНК к мутациям?

15.Что такое мутация?

Вопросы для самостоятельной работы

1.Репарация как процесс сохранения целостности структуры ДНК.

2.Типы репараций ДНК.

42

Глава 5. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ

Появление термина «мониторинг» (от англ. мonitoring – контроль) связан с необходимостью наблюдения за состоянием окружающей среды. Целью генетического мониторинга являются:

1)слежение за появлением и накоплением в компонентах окружающей среды генотоксичных соединений;

2)наблюдение за уровнем мутационного груза в популяциях человека.

Мониторинг накопления и распространения генотоксикантов в окружающей среде. В настоящее время для осуществления мониторинга применяются три основных подхода.

1.Проведение натурных исследований на растительных и животных объектах в условиях производства и в экологически опасных регионах.

2.Анализ суммарной мутагенности образцов различных компонентов среды (атмосферного воздуха и воздуха рабочей зоны на предприятиях, питьевой воды и воды в водоисточниках, почвы и пищевых продуктов, и пр.) на лабораторных тест-объектах.

3.Оценка суммарной генотоксичности стандартизированных образцов проб воздуха, воды и др. как в производственной сфере, так и в жилой зоне.

Натурные исследования. Для генетического мониторинга накопления

вокружающей среде и в производственных помещениях используются различные растительные тест-объекты (табл. 1).

Таблица 1

Наиболее часто используемые для генетического мониторинга растительные тест-системы (Гераськин и др., 2010)

43

Хорошо разработанным методом для изучения повреждения хромосом in vivo является анализ метафазных хромосом в клетках костного мозга крыс, мышей или хомячков. Хромосомные фрагменты в клетках костного мозга и других тканей можно идентифицировать в виде микроядер. Микроядерный тест зарекомендовал себя как сравнительно простой метод выявления химических веществ, способных индуцировать хромосомные повреждения.

Для изучения в естественных условиях действия химических мутагенов могут быть пригодны грызуны и амфибии, ареалы которых легко и достоверно определяются экологическими методами (Биологический контроль окружающей среды, 2010).

Анализ суммарной мутагенности образцов различных компонентов среды. Наиболее важным вопросом в оценке суммарной мутагенности загрязнений различных объектов окружающей среды является отбор и подготовка проб для тестирования их на генотоксичность.

К концентрированию проб воздуха, воды и других образцов прибегают из-за низких (для выявления мутагенов на генетических тест-объектах) концентраций в них генотоксикантов. Экстракция, как правило, осуществляется органическими растворителями. Чаще всего используют ацетон, бензол и диметилсульфоксид (Кулешов, Шрам, 1982).

Генетический мониторинг популяций человека

Генетический мониторинг популяций человека проводится для оценки динамики изменения параметров генетического груза и других адаптивнозначимых признаков в популяции во времени и пространстве.

Мутационный процесс в популяциях определяется мутациями, происходящими только в половых клетках, и, соответственно, попадающими в генофонд популяции. Мутации в соматических клетках приводят к возрастанию риска возникновения злокачественных новообразований и, таким образом, снижают жизнеспособность организма, но не передаются по наследству.

Мутации, в той или иной мере снижающие жизнеспособность их носителей, относятся к генетическому грузу популяции. В качестве параметров

44

генетического груза можно использовать следующие данные медицинской статистики:

отдельные наследственные заболевания или заболевания с наследственным предрасположением;

врожденные пороки развития (ВПР) – все или индикаторные фенотипы; спонтанные аборты; перинатальная смертность; младенческая смертность;

онкозаболеваемость или смертность.

Размер генетического груза популяции определяется величиной мутационного груза (вновь возникающие мутации) и сегрегационного груза (наличие в популяции гетерозиготных генотипов полиморфных (сегрегирующих) локусов, выщепляющих менее приспособленные гомозиготные генотипы. Выделяют также субституционный груз, который выявляется при изменении адаптивной ценности генотипа (например, при переселении в другие условия) (Алтухов, Салменкова, Курбатова, 2004).

Часть генных мутаций не проявляется на уровне структуры белка. Такие нейтральные мутации составляют огромный генетический полиморфизм. Хотя, строго говоря, нейтральных мутаций не существует. Установлено, что наличие того или иного аллеля определяет предрасположенность его носителя к развитию определенных мультифакториальных заболеваний.

Методы мониторинга популяций человека.

1.Биохимический мониторинг предполагает слежение за частотой вновь возникающих мутаций по результатам изучения полиморфизма белков крови человека. С помощью данного подхода можно оценить частоту генных мутаций.

2.Цитогенетический мониторинг – это мониторинг учета хромосом-

ных аномалий. Для оценки влияния факторов внешней среды широко используются методы учета частот хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека.

З. Учет «специфических фенотипов». Под специфическим фенотипом подразумевается заболевание, возникающее спорадически, является следствием мутации одного гена (аутосомно-доминантный или сцепленный с Х-хромосомой тип наследования, встречающийся с относительно высокой частотой и легко распознаваемый в неонатальном периоде). Сейчас известно более 40 таких заболеваний (нейрофиброматоз, ахондроплазия, несовершенный остеогенез, поликистоз почек и т. д.).

4.Учет спонтанных абортов и врожденных пороков развития (ВПР).

Данный метод имеет ряд преимуществ:

впроисхождении спонтанных абортов и врожденных пороков развития значительное место занимает мутационная компонента;

45

популяционная распространенность спонтанных абортов и врожденных пороков развития достаточно велика, что по сравнению с описанными выше методами требует меньшего размера выборки;

изучаемые показатели регистрируются в медицинских учреждениях, что делает их легкодоступными для анализа и обеспечивает возможность изучения динамики их частоты по годам.

Считается, что около 50 % спонтанных абортов происходит в результате наличия у плода разных генетических нарушений. Причем, чем на более раннем сроке произошел спонтанный аборт, тем выше вероятность у него хромосомных перестроек.

Среди всех ВПР для целей генетического мониторинга наиболее приемлемы ВПР, на долю которых приходится до 20 % от всех врожденных пороков развития. Это обусловлено тем, что в эпидемиологии множественных ВПР в 40-50 % случаях имеют место различные хромосомные перестройки. Эпидемиологическое исследование спонтанных абортов и врожденных пороков развития можно проводить ретроспективно. Этот метод чаще всего и используется (Кулешов, Шрам, 1982).

Тематика рефератов

1.Генетический мониторинг окружающей среды.

2.Методы генетического мониторинга окружающей среды.

3.Генетический мониторинг человеческой популяции: цели и методы.

Контрольные вопросы и задания

1.Что такое генетический мониторинг?

2.Какие виды генетического мониторинга существуют?

3.Как анализируется мутагенная активность загрязнителей воздуха?

4.Как анализируется мутагенная активность загрязнителей воды?

5.Как анализируется мутагенная активность воздуха промышленных помещений?

6.Что означает генетический мониторинг человеческих популяций?

7.Что такое генетический груз?

8.Какие методы используются для мониторинга человеческих популяций?

9.Что дает учет врожденных пороков развития?

10.Какую информацию можно получить при проведении биохимического мониторинга и цитогенетического мониторинга?

Вопросы для самостоятельной работы

1.Генетический груз и мутационный процесс.

2.Генетический мониторинг природных популяций.

46

Глава 6. ТЕСТ-СИСТЕМЫ И ОЦЕНКА ГЕНОТОКСИЧНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

Невозможность проведения прямой оценки мутагенной опасности химических соединений непосредственно у человека привела к созданию различных тест-систем. В настоящее время для изучения генотоксичности химических соединений применяется около 200 тест-систем, из которых около 20 методов хорошо разработаны и нашли широкое применение (Биологический контроль окружающей среды, 2010).

В качестве объектов при массовом определении генетической активности тех или иных факторов используют культуры клеток человека и животных, высшие растения, микроорганизмы, D. melanogaster (табл. 2).

Таблица 2

Тест-системы для быстрой оценки генетической активности химических соединений) (Инге-Вечтомов, 1989)

47

Продолжение таблицы 2

4. Культуры клеток млекопитающих

Гепатоциты крыс и др. Одноцепочечные разрывы ДНК Внеплановый синтез ДНК

Человек – HeLa

Лимфоциты человека Цитогенетические эффекты: хромосомные аберрации, обмены сестринских хроматид Генные мутации устойчивости

Тест Эймса Salmonella/микросомы. Метод, предложенный Б. Эймсом в 1973 г. позволяет регистрировать способность испытуемого соединения или его метаболитов индуцировать генные мутации типа замены пар оснований или сдвига рамки считывания в тестерных штаммах Salmonella typhimurium. Тестерные бактерии являются ауксотрофами по гистидину и мутагенный эффект регистрируется по индукции обратных мутаций от ауксотрофности к прототрофности. Метод – полуколичественный, учитывает не частоту мутаций, а количество селектируемых мутантов в опытных и контрольных чашках.

Для метаболической активации тестируемых химических соединений используют активирующую смесь, состоящую из гомогената (фракции S-9) печени крыс, кофакторов НАДФ и глюкозо-6-фосфата.

Тесты по учёту хромосомных аберраций in vitro. Цитогенетические тесты in vitro позволяют учитывать хромосомные аберрации в культивируемых клетках, видимых под световым микроскопом. Обычно в этих тестах клетки изучают на стадии метафазы. Химическое соединение классифицируется как кластоген, если оно вызывает увеличение числа разрывов хромосом по сравнению с контрольными образцами. В этих тестах наиболее широко используются клетки двух типов: СНО – перевиваемая линия фибробластов, выделенных из яичника китайского хомячка, и лимфоциты (моноядерные лейкоциты) периферической крови человека. Используются и другие клеточные линии.

Тесты по учёту генных мутаций in vitro. Используются культиви-

руемые клетки человека, крысы, мыши, хомячка, а также самые разнообразные селективные системы для отбора прямых и обратных мутаций. На практике широкое распространение получили клетки китайского хомячка V79 и СНО, а также клетки мышиной лимфомы L4178Y. В качестве генетических систем как основы для отбора мутантов служат гены ГГФРТ (гипоксантин- гуанин-фосфорибозилтрансфераза) и Na+/K+-ATФазы. В первом случае в качестве селективного агента используют 8-азагуанин или 6-тиогуанин, в во втором – оуабаин. Также разработана клеточная линия L5178Y, гетерозиготная по локусу гена тимидинкиназы ТК (L5178Y ТК+/-), которая интенсивно используется в тестах на мутагенность для отбора мутантов по ТК.

48

Цитогенетические тесты in vivo. В этих тестах анализируются, главным образом, клетки костного мозга для выявления кластогенных химических соединений, способных вызывать структурные изменения хромосом.

Учет хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей. Хро-

мосомные аберрации анализируют в метафазах митотического деления клеток пролиферирующих тканей, например костного мозга лабораторных животных. Клетки костного мозга характеризуются высокой митотической активностью и стабильностью уровня спонтанного возникновения аберрантных хромосом – порядка 1 %.

Микроядерный тест является цитогенетическим методом выявления микроядер, формирующихся в цитоплазме созревающих эритроцитов из ацентрических фрагментов или целых хромосом, утраченных ядром во время деления пронормобласта. Микроядерный тест на ретикулоцитах костного мозга широко применяется на первом этапе оценки мутагенной активности химических соединений на млекопитающих.

Тест по учёту доминантных леталей у грызунов. Доминантная ле-

таль (доминантная летальная мутация) – это генетические изменения в гамете, которые приводят к гибели плода на ранних стадиях развития. Большинство доминантных леталей являются результатом численных и структурных изменений хромосом в половых клетках.

Метод в основе своей сводится к последовательным спариваниям самцов с интактными самками, подвергавшихся и не подвергавшихся воздействию тестируемого вещества. Сразу же после затравки к каждому обработанному и контрольному самцу подсаживают виргинных самок. Подсадки самок проводят еженедельно в течение 3 недель, чтобы анализировать доминантные летали на постмейотических стадиях сперматогенеза.

Эмбриональная гибель плодов у самок в первую неделю после введения химического вещества будет свидетельствовать о мутационных событиях, произошедших в зрелых сперматозоидах, 2 неделя соответствует поздним сперматидам, 3 неделя – ранним и средним сперматидам. Беременных самок забивают на 14–16-й день беременности. Производят подсчёт жёлтых тел, отражающих потерю яйцеклеток.

Основным показателем уровня доминантных летальных мутаций служит уровень постимплантационных потерь, представляющий отношение числа мертвых эмбрионов к сумме живых и мертвых эмбрионов. Индукция доминантных леталей определяется по превышению уровня постимплантационной гибели зигот в экспериментальной группе над этим показателем для контрольной группы.

Тест по учёту наследуемых транслокаций. Тест на наследуемые транслокации у грызунов используют чтобы охарактеризовать возможный генетический риск мутагенов окружающей среды для зародышевых клеток млекопитающих. Реципрокные транслокации являются результатом разрывов

49

в 2-х негомологичных хромосомах и взаимного обмена фрагментами. Транслокационные гетерозиготы легко распознаются цитологически по характерным спаренным конфигурациям, формируемым в течение профазы и метафазы первого деления мейоза. Наблюдениям подвергаются сперматоциты обработанных самцов и сперматоциты F1 поколения самцов.

Метод специфических локусов на мышах. Метод регистрирует ви-

димые мутации в специфических локусах. Сущность метода заключается в том, что при скрещивании испытуемого самца – предполагаемого носителя мутации, с самками тестерной линии, гомозиготной по рецессивным аллелям 7 генов, в гетерозиготном потомстве F1 фенотипически проявляется индуцированная рецессивная аллель одного и из этих генов. Учет проводится по семи локусам, в которых могут быть определены специфические мутации в грудном возрасте: не-агути (a), коричневый (b), альбинос (c), светло-розовые глаза (p), светлый мальтийский (d), короткое ухо (se), пегий (s). Они локализованы на пяти различных хромосомах, причём p и c локусы являются связанными, также как d и se локусы (Белицкий, Худолей, 1986; Биологический контроль окружающей среды, 2010; Дурнев, Середенин, 1998).

Правила тестирования. В настоящее время к тестированию, особенно для биологически активных соединений, предъявляются жесткие требования, которые определены нормативными положениями ряда международных документов. К ним относятся: Надлежащая лабораторная практика (Good Laboratory Practice (GLP), Руководство по обеспечению качества доклинически (неклинических) исследований UNDP/World Bank/WHO, Правила Организации по экономическому сотрудничеству и развитию (The Organisation for

Economic Cooperation and Development – OECD).

Требования GLP направлены на обеспечение научной значимости исследований, полной документированности, достоверности и признаваемости полученных результатов.

OECD – это международный орган, одной из функций которого является разработка и опубликование официально согласованных руководств по тестированию химических соединений. Это гарантирует, что полученные результаты могут быть приняты во всех странах, принявших эти правила, и помогает предотвратить дублирование испытаний в различных странах (Методические указания по экспериментальной оценке суммарной мутагенной активности загрязнений воздуха и воды, 1990).

Многие исследователи предложили различные варианты ступенчатых систем тестирования мутагенов и протоонкогенов, основу которых составляет скрининг, или просеивание большого числа веществ на ситстемах, позволяющих быстро оценивать их генетическую активностью.

Н.П. Бочковым и др. (1991) был предложен вариант ступенчатой системы тестов для выявления генетической активности у лекарственных препаратов с учетом характера их применения (рис. 4).

50