Генетическая токсикология. Учебное пособие

Понятие о чистых линиях. Датский генетик В. Иоганнсен изучал наследование массы и размера семян фасоли. Он высевал самые мелкие семена и самые крупные и получал от них потомство. С растений, выросших из самых мелких семян, брались опять самые мелкие, а с растений, выросших из крупных семян, брались самые крупные. После такой процедуры, проводившейся для ряда самоопыляющихся поколений, оказалось, что соотношение семян разного размера (мелких, средних и крупных) было одинаковым у отбираемых растений, выросших из самых мелких семян, и выросших из самых крупных семян. При этом оно не отличалось от соотношения, которое было у исходного родительского растения.

Размеры семян были обусловлены разными случайными причинами (одни формировались, когда было больше солнца, другие, когда было больше влаги и т.д.). Но генотип у всех растений был одинаков и отбор не мог изменить соотношение размеров. Это показало, что отбор среди потомков чистых линий (гомозиготных) не эффективен. Разброс размеров горошин, возникавший под влиянием случайных причин, подчинялся определенной закономерности. Больше всего было горошин некоторого среднего размера. Меньше всего было особенно мелких и особенно крупных семян. Распределение их по размеру является одним из примеров нормального распределения (Айала, Кайгер,

1988).

Нормальное распределение. Для количественных признаков, таких как вес и размер семян, рост и вес животных и др. распределение в популяции имеет колоколообразную форму, где для большинства особей характерны средние значения признака. Математическая кривая, имеющая такую форму, называется нормальным распределением. Оно характеризуется средним значением и стандартным отклонением (рис. 2).

Рис. 2. Нормированное распределение

12

При нормальном распределении 50 % выборки (или результатов наблюдении попадает в интервал, заключенный между значениями – 0,67σ (сигма) и + 0,67σ и 95 % выборки – в интервале – 1,96σ и +1,96σ. Принято, что при нормальном распределении 95 % выборки должно попасть в последний интервал. При отклонении от этой нормы выборка не будет соответствовать требованиям нормального распределения, и соответственно, она не может считаться чистой линией (Клаг, Каммингс, 2009).

2.2. Наследственная изменчивость

Наследственная изменчивость (генетическая, или генотипическая изменчивость) обусловлена изменением генотипа. В основе генетической изменчивости лежит мутационная и комбинативная изменчивость.

Комбинативная изменчивость – это перекомбинация генов родителей у потомков без изменения структуры генетического материала. Механизмы комбинативной изменчивости:

1)свободное комбинирование хромосом и хроматид при расхождении их в мейозе;

2)кроссинговер при мейозе (рекомбинация генов);

3)случайная встреча гамет разного типа при оплодотворении. Комбинативная изменчивость является главным источником генетиче-

ского разнообразия (Филипченко, 2012).

Мутационная изменчивость обусловлена мутациями – устойчивым изменением генетического материала.

Термин «мутация» был предложен в 1901 г. голландским ботаником Хьюго (Гуго) Де Фризом Он в течение многих лет проводил опыты с широко распространенным сорным растением – ослинником двулетним, или энотерой (Oenothera biennis), и случайно обнаружил у нее экземпляры, отличающиеся от исходных форм большим ростом или другими изменениями. При размножении семенами новые формы энотеры стойко сохраняли в поколениях свои особенности.

В результате обобщения своих наблюдений Г.Де Фриз сформулировал основные положения мутационной теории, которые сводятся к следующему:

мутации возникают внезапно как дискретные изменения признаков; мутантные формы устойчивы; мутации – это качественные изменения, которые не образуют непре-

рывных рядов, не группируются вокруг среднего типа; мутации проявляются по-разному, и они могут быть как полезными,

так и вредными; вероятность обнаружения мутаций зависит от числа исследованных особей;

сходные мутации могут возникать неоднократно.

13

В настоящее время принято следующее определение мутаций (Син-

гер, 1998): мутации – это наследуемые изменения генетического материала.

Мутации представляют собой как качественные, так и количественные изменения в геноме организма (Ауэрбах, 1978).

Мутации возникают спонтанно и случайно, т.е. невозможно предсказать: где, когда и какое изменение произойдет. Можно только оценить вероятность мутации в популяциях, зная фактические частоты определенных мутаций. Организм, во всех клетках которого обнаруживается мутация, называется мутантом. В ряде случаев мутация обнаруживается не во всех соматических клетках организма; такой организм называют генетическим мозаиком. Это происходит, если мутации появляются в ходе онтогенеза – индивидуального развития.

Доказательство того, что мутации у бактерий возникают спонтанно, было получено в экспериментах С. Лурия и М. Дельбрюка в 1943 году мето-

дом, получившим название флуктуационный тест Лурия и Дельбрюка (Ду-

бинин, 1994).

Множественные аллели и генетический полиморфизм. В одном и том же гене могут возникать разные мутации: тогда возникают серии множественных аллелей. Например, у кроликов ген, определяющий степень выраженности альбинизма, представлен последовательно доминирующими аллелями: C (нормальная, неальбинистическая окраска) >cch (шиншилловая) >ch (горностаевая) >с (полный альбинизм). Исходное, нормальное состояние аллеля традиционно называется диким типом (часто обозначается символом +). Диким типом называют также нормальный генотип и нормальный фенотип. Сочетание двух мутантных аллелей называется компаундом (например, wch// wbf или at// a).

Множественный аллелизм является основой генетического полиморфизма в популяции, когда частота даже наиболее редко встречающихся генотипов в популяциях превышают 1% (Инге-Вечтомов, 2010).

Классификации мутаций. Мутации классифицируют на основании различных критериев. Изменение нормального аллеля в мутантную форму называется прямой мутацией (например, переход А → а), а возврат мутантного аллеля к исходному состоянию – обратной мутацией, или реверсией (например, обратный переход а → А).

Соматические мутации не затрагивают половые клетки и не передаются потомкам. Генеративные мутации происходят в гаметах или в тканях, образующих гаметы и передаются потомкам. При сочетании гамет с идентичными мутациями образуются полностью мутантные организмы. Аутосом- но-доминантые мутации проявляются в фенотипе первого поколения. Ауто- сомно-рецессивные мутации в мужских и женских гаметах могут оставаться незамеченным в течение нескольких поколений из-за гетерозиготности носителей. Х-сцепленные рецессивные мутации, возникшие в гаметах женского пола, могут проявиться у потомков мужского пола, если они получили от матери мутантную хромосому.

14

По фенотипическому проявлению различают следующие мутации: биохимические (изменяется структура белков); физиолого-биохимические (изменяется обмен веществ); онтогенетические (изменяется характер онтогенеза); физио- лого-репродуктивные (изменяются плодовитость, границы репродуктивного периода); анатомо-морфологические (изменяется внутреннее и внешнее строение организмов); этологические (поведенческие) (Филипченко, 2012).

В отдельный тип выделены динамические мутации, или мутации экс-

пансии. В их основе лежит увеличение (экспансия) числа копий коротких повторяющихся последовательностей (CGG)n, (CTG)n, (CAG)n в кодирующих и некодирующих частях генов. В основе механизма экспансии лежит нарушение процесса репликации микросателлитной ДНК, в частности, скольжение (slippage) в репликативной вилке. Мутации такого типа зарегистрированы только у человека. Практически для всех «болезней экспансии» характерно поражение подкорковых структур головного мозга, причем тяжесть заболевания и его начало положительно коррелируют с числом повторов.

Другой класс мутаций — это мутации, возникающие вследствие инсерций (вставок) мобильных генетических элементов (МГЭ). Существует различие между индукцией точковых мутаций и инсерций. При обработке мутагенами частоту точковых мутаций можно увеличить. А результаты перемещения МГЭ от действия мутагенов не зависят.

По уровню организации генетического материала, затронутого изменением,

все мутации делят на генные, хромосомные и геномные (Сингер, 1998).

Общие закономерности мутационной изменчивости

Изучая наследственную изменчивость культурных растений и их предков, Н.И. Вавилов сформулировал закон гомологических рядов: «Виды и роды, генетически близкие, характеризуются сходными рядами наследственной изменчивости с такой правильностью, что зная ряд форм в пределах одного вида, можно предвидеть нахождение параллельных форм у других видов и родов».

На примере семейства злаковых, Н.И. Вавилов показал, что сходные мутации обнаруживаются у целого ряда видов этого семейства. Так, черная окраска семян встречается у ржи, пшеницы, ячменя, кукурузы и других, за исключением овса, пырея, проса. Удлиненная форма зерна – у всех изученных видов.

Таким образом, обнаружение мутаций у одного вида дает основание для поисков сходных мутаций у родственных видов растений и животных (Инге-Вечтомов, 2010).

2.2.1. Генные мутации

Генные мутации – это изменение структуры ДНК в пределах отдельного гена. Эти мутации условно можно разделить на две группы: точковые и структурные.

15

О точковых мутациях говорят в том случае, когда изменение затрагивает лишь один или несколько нуклеотидов. По своим последствиям точковые мутации делятся на две группы: мутации замены пар оснований и му-

тации со сдвигом рамки считывания.

Мутации типа замены пар оснований делятся на два класса: транзиции

и трансверсии. Транзиции заключаются в замене одного пурина на другой пурин (аденин ↔ гуанин) или пиримидина на пиримидин (цитозин ↔ тимин). Трансверсии – в замене пурина на пиримидин или наоборот (цитозин/тимин ↔ аденин/гуанин).

Замены нуклеотидных пар в молекуле ДНК приводят к следующим генетическим последствиям.

1.Изменение смысла кодона, приводящее к замене аминокислоты в соответствующем месте полипептидной цепи (миссенс-мутация).

2.Сохранение смысла кодона благодаря вырожденности генетического кода (сеймсенс-мутация). Все аминокислоты, кроме метионина и триптофана, кодируются не одним, а двумя, тремя и более кодонами каждая.

3.Образование бессмысленного кодона с преждевременной терминацией (нонсенс-мутация). В генетическом коде имеются три бессмысленных кодона: амбер – UAG, охра – UAA и опал – UGA. Соответственно мутации, приводящие к образованию бессмысленных триплетов – называются амбер-, охра- и опалмутациями. Нонсенс мутации чаще летальны. Они снижают активность всех генов того же оперона.

4.Обратная замена (стоп-кодона на смысловой кодон). Вышеуказанные типы мутаций можно охарактеризовать на примере

замен пар оснований в гене гемоглобина человека (Айала, Кайгер, 1988).

Мутации со сдвигом рамки считывания (фреймшифты) составляют значительную долю всех спонтанных мутаций и происходят в результате вставки или потери нуклеотидных пар. При этом изменяется общая длина ДНК изменяется и, соответственно, происходит полное изменение структуры белка. Однако если после вставки пары нуклеотидов происходит потеря пары нуклеотидов (или наоборот), то аминокислотный состав белков может восстановиться. Тогда две мутации хотя бы частично компенсируют друг друга.

Это явление называется внутригенной супрессией.

Мутации со сдвигом рамки считывания составляют 80 % от всех генных мутаций. Вставки иначе называются инсерциями, а потери – эксцизиями. Процесс образования вставок называется инсерционным мутагенезом.

Нонсенс-мутации составляют особую группу генных мутаций, поскольку они приводят к появлению стоп-кодонов. Эти мутации могут возникать как вследствие замен нуклеотидных пар, так и с потерями или вставками. С появлением стоп-кодонов синтез полипептида обрывается. Кроме того, мутация в одном гене может подавлять мутации, происходящие в других (неаллельных) генах. Это явление называется межгенной супрессией.

16

Некоторые мутации обладают плейотропным действием, т.е. приводят к изменению сразу нескольких признаков. Например, ароматические аминокислоты – триптофан, фенилаланин, тирозин – образуются из хоризмовой кислоты. Если некоторая мутация заблокирует хотя бы один этап синтеза хоризмовой кислоты, то клетка (организм) утрачивает способность к синтезу сразу трех аминокислот (Льюин, 2011).

Структурные генные мутации

Наиболее простым типом структурных генных мутаций является делеция или инсерция части или целого генного участка. Протяженные делеции приводят к тяжелым заболеваниям. Например, крупные делеции (более 100 нуклеотидов) отмечены у 5 % больных гемофилией A, вызванной мутациями в гене фактора свертывания крови VIII.

К структурным мутациям гена относятся и динамические мутации, открытые в 1990-е годы и зарегистрированные только у человека. Они представляют собой превышение числа повторяющихся тринуклеотидных последовательностей, локализованных в кодирующих или регуляторных областях гена.

В основе механизма экспансии лежит нарушение процесса репликации микросателлитной ДНК, в частности, скольжение (slippage) в репликативной вилке.

Тринуклеотидные повторы представлены и в нормальных генах, их количество поддерживается стабильным и не нарушает нормальной функции гена. Однако если их число превысит определенный критический уровень, развиваются заболевания и нарастание тяжести клинических проявлений в последующих поколениях (так называемая антиципация).

Структурные изменения генов и отдельных сегментов генома размером от 1 кб до миллионов пар нуклеотидов принято классифицировать как вариации числа копий – CNV (англ. сopy number variation) (Льюин, 2012; Патрушев, 2000).

Методы выявления и количественного учета генных мутаций

Сложность выявления генных мутаций связана, во-первых, с рецессивностью большинства мутаций (вероятность их фенотипического проявления ничтожно мала), а во вторых с летальностью многих из них (мутанты не выживают).

Все множество методов выявления генных мутаций можно разделить на две группы: методы генетического анализа и биохимические методы.

1. Методы генетического анализа основаны на скрещивании возможных носителей мутации с тестерными линиями (линиями-анализаторами). Самый простой метод – это скрещивание носителей предполагаемой мутации с соответствующей рецессивно-гомозиготной линией, т.е. обычное анализирующее скрещивание. Наиболее известны метод учета мутаций в специфических локусах у мышей и метод учета рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций у дрозофилы.

17

2.Биохимические методы выявления мутаций исключительно разно-

образны и основаны на применении различных методик.

1.Метод селективных сред. Используется для выявления определенных биохимических продуктов мутантных генов. Например, у микроорганизмов и в культуре животных и растительных клеток на селективных питательных средах выявляются ауксотрофные формы, не способные синтезировать определенные вещества (по сравнению с нормальными, прототрофными формами) или устойчивые к селективному агенту.

2.Методики, основанные на непосредственном выявлении измененных нуклеиновых кислот и белков с помощью гель-электрофореза в сочетании с другими методиками (блот-гибридизации, рестрикции, авторадиографии).

3.Метод прямого секвенирования мутировавшего локуса ДНК (Айала, Кайгер, 1988).

Причины возникновения мутаций

По причинам возникновения различают спонтанные и индуцированные мутации.

Спонтанные (самопроизвольные) мутации возникают без видимых причин и принято рассматривать их как результат ошибки генетических про-

цессов репликации, репарации и рекомбинации ДНК. Это означает, что про-

цесс возникновения новых мутаций находится под генетическим контролем организма. Например, известны гены-мутаторы и гены-антимутаторы, которые повышают или понижают частоту других мутаций.

Главной причиной ошибок репликации является существование оснований ДНК в нескольких таутомерных формах. Например, аденин в редкой иминоформе спаривается с цитозином, а не с тимином, что при последующей репликации приводит к транзиции АТ→ГЦ. Другая причина – неисправленные ДНК-полимеразой ошибки репликации (Айала, Кайгер, 1988).

Мутации могут быть индуцированы физическими (ионизирующая радиация ультрафиолетовое излучение) и химическими мутагенами. При этом мутации возникают не мгновенно. Вначале под воздействием мутагенов возникает предмутационное состояние клетки. Различные репарационные системы стремятся устранить это состояние, и тогда мутация не реализуется (Жимулев, 2003).

2.2.2. Хромосомные перестройки (аберрации)

Хромосомными перестройками, или хромосомными мутациями называ-

ются видимые изменения структуры хромосом. Хромосомные аберрации, в отличие от генных мутаций, всегда неповторимы и уникальны. Различают внутрихромосомные аберрации (фрагментацию, делиции, дефишенси, дупликации, инверсии, транспозиции) и межхромосомные (транслокации) (Шевченко, 2004).

18

Основные типы хромосомных аберраций

Фрагментация – это дробление хромосом с образованием множества различных фрагментов.

Делеции (нехватки внутренних участков) – потери участков хромосом, не затрагивающие теломеры. Утраченные участки, лишенные центромер, обычно образуют кольцевые ацентрики, которые также утрачиваются.

Дефишенси (концевые нехватки) – потери концевых, теломерных участков хромосом. В результате образуются линейные фрагменты, лишенные центромеры (линейные ацентрики). Ацентрики не участвуют в делении клетки и утрачиваются.

Дупликации – это удвоения участков хромосом. В результате возникают тандемные последовательности генов. Дупликации – один из путей возникновения новых генов.

Инверсии – повороты участков хромосом на 180°. Различают перицентрические инверсии (инвертированный участок включает центромеру) и парацентрические (инвертированный участок лежит в одном из плеч хромосомы вне центромеры). У гетерозигот при перекресте нормальных и инвертированных хромосом возникают ацентрики и дицентрики; в результате возникают неполноценные клетки, и продукты кроссинговера не переходят в последующие поколения (поэтому инверсии образно называют «запирателями кроссинговера»).

Транспозиции – это перемещения участков хромосомы в другие локусы этой же хромосомы. Существуют участки хромосом, склонные к транспозициям, их называют мобильными генетическими элементами, или транспозонами. Транспозиции являются причиной инсерционного мутагенеза. Кроме того, при транспозициях гены, изменившие свое положение, могут изменять свою активность – такое явление называется эффектом положения. В результате эффекта положения гены могут изменять свои первоначальные функции.

Инсерционный мутагенез подразумевает собой инсерции любых последовательностей ДНК в любой участок генома. Наиболее часто инсерционные мутации встречаются при спонтанных хромосомных перестройках и при миграции мобильных элементов генома.

Транслокации – это перемещения участков хромосомы или всей хромосомы в другую хромосому. В некоторых случаях происходит полное слияние гомологичных хромосом с образованием двуцентромерных структур – дицентриков. В других случаях из двух акроцентрических хромосом образуется одноцентромерная двуплечая хромосома. Такое слияние хромосом называется робертсоновской транслокацией.

Робертсоновские транслокации часто встречаются у грызунов и, возможно, являются причиной различий между числом хромосом у близкородственных видов.

Реципрокная транслокация между двумя негомологичными хромосомами приводит к образованию при конъюгации не бивалента, а квадривален-

19

та, в котором хромосомы образуют фигуру креста благодаря притягиванию гомологичных участков, расположенных в разных хромосомах. Участие в реципрокных транслокациях большего числа хромосом с образованием поливалента сопровождается формированием еще более сложных структур при конъюгации (Сингер, Берг, 1998; Шевченко, 2004).

Механизмы возникновения хромосомных аберраций разнообразны:

неравный кроссинговер между гомологичными хромосомами (возникают делеции и дупликации) и негомологичными хромосомами (возникают транслокации);

разрывы хромосом (возникают различные фрагменты); разрывы хромосом с последующим соединением фрагментов (возни-

кают инверсии, транспозиции, транслокации); копирование гена и перенос копии в другой участок хромосомы

(возникают транспозиции).

Хромосомные аберрации могут возникать спонтанно, без видимых причин, а также под действием мутагенных химических соединений и ионизирующего излучения. В последнем случае возникают как одиночные разрывы хромосом, так и двойные (или множественные). Одиночные разрывы ведут к появлению концевых нехваток, двойные (множественные) разрывы – к появлению всех остальных типов аберраций. При разрывах на пресинтетической стадии изменяется вся хромосома и наблюдаются двойные аберрации; при разрывах на постсинтетической стадии изменяется только одна хроматида и наблюдаются одиночные аберрации (Фогель, Мотульски, 1989).

Методы выявления хромосомных аберраций

Для выявления хромосомных аберраций используются различные методы цитогенетического анализа:

Метафазный анализ позволяет регистрировать большое количество типов аберраций, определяет тип перестройки и в какой именно хромосоме она произошла. Но этот метод пригоден только для объектов, для которых уже идентифицированы все хромосомы, определен кариотип. Метафазный анализ более сложный и требует высокой квалификации исследователя. Этот метод используется, например, для диагностики хромосомных болезней человека.

Ана-телофазный анализ позволяет выявить мосты и отставания (дицентрики и другие продукты транслокаций), фрагменты (ацентрики). Метод простой, экономичный, не требует знания кариотипа и идентификации типов повреждений хромосом. Он позволяет регистрировать меньшее типов аберраций, но его чувствительность вполне достаточна для заключения «мутагенен» или «не мутагенен» фактор.

Гибридизация in situ с флуоресцентной меткой (FISH). Принцип метода основан на гибридизации меченых флуоресцентными метками специфических ДНК-зондов с хромосомной ДНК. FISH является чувствительным методом цитогенетического анализа при выявлении количественных и качественных

20