Генетическая токсикология. Учебное пособие

Поскольку нет никаких других сведений, приходится оценивать риск появления наследственных дефектов у человека, основываясь на результатах, полученных в многочисленных экспериментах на животных. При оценке риска появления наследственных дефектов у человека НКДАР ООН использует два подхода. При одном подходе пытаются определить непосредственный эффект данной дозы облучения, при другом стараются определить дозу, при которой удваивается частота появления потомков с той или иной разновидностью наследственных дефектов по сравнению с нормальными радиационными условиями.

Согласно оценкам, полученным при первом подходе, доза в 1 Гр, полученная при низком уровне радиации только особями мужского пола, индуцирует появление от 1000 до 2000 мутаций, приводящих к серьезным последствиям, и от 30 до 1000 хромосомных аберраций на каждый миллион живых новорожденных.

Согласно оценкам, полученным вторым методом, хроническое облучение при мощности дозы в 1 Гр на поколение (для человека – 30 лет) приведет к появлению около 2000 серьезных случаев генетических заболеваний на каждый миллион живых новорожденных среди детей тех, кто подвергся такому облучению. Этим методом пользуются также для оценки суммарной частоты появления серьезных наследственных дефектов в каждом поколении при условии, что тот же уровень радиации будет действовать все время. Согласно этим оценкам, примерно 15 000 живых новорожденных из каждого миллиона будут рождаться с серьезными наследственными дефектами из-за такого радиационного фона. Хроническое облучение слабее действует на живой организм по сравнению с однократным облучением в той же дозе, что связано с постоянно идущими процессами восстановления радиационных повреждений. Считается, что примерно 90 % радиационных повреждений восстанавливается (Тарасов, 1982).

3.3.Ультрафиолетовое излучение

Вотличие от ионизирующего излучения, фотоны ультрафиолетового (УФ) света обладают малой энергией, которая недостаточна для вызывания ионизации. Биологическое действие УФ обусловлено в основном процессами возбуждения молекул, что в последующем приводит к их изменениям.

ДНК интенсивно поглощает жесткий ультрафиолет с длиной волны ≈254 нм. Наиболее интенсивно поглощают УФ-свет пиримидиновые основания, что приводит к образованию димеров «тимин-тимин» и «тиминцитозин». Наряду с димерами в структуре ДНК под влиянием УФ-света возникают и другие фотопродукты: фотогидраты пиримидинов, тиминовые гликоли, сшивки ДНК-белок. УФ может также вызывать одно- и двунитевые разрывы в молекуле ДНК. Однако для этого требуются дозы облучения на 3- 4 порядка выше, чем при образовании димеров. Поэтому считается, что в

31

механизме биологического действия УФ-света, в отличие от ионизирующей радиации, этот механизм серьезного значения не имеет. Сшивки ДНК-белок образуются между пиримидиновыми основаниями ДНК и сульфидными и/или гидроксильными группами аминокислот (рис. 3).

Рис. 3. Образование тиминового димера под действием УФ-света

Существенную роль в понимании механизма действия УФ-света сыграло открытие А. Кельнером и Р. Дюльбекко в 1949 г. явления фотореактивации, которая заключалась в восстановлении УФ-повреждений ДНК квантами видимого света. Вскоре было показано, что фотореактивация осуществляется ферментом фотолиазой, которая в темноте связывается с областью ДНК, содержащей димеры тимина. Энергия видимого света обеспечивает последующее фотокаталитическое расщепление пиримидиновых димеров и восстановление нормальной структуры ДНК. Были проведены многочисленные работы по изучению эффективности фотореактивации от различных условий облучения видимым светом и физиологического состояния клетки. В опытах с актиномицетами было показано, что если видимый свет включается сразу после обработки УФ-светом, то 98 % мутаций фотореактивируется.

С изучением механизма действия УФ-излучения на микроорганизмы связано открытие в начале 1960-х годов эксцизионной репарации повреждений ДНК, получившей название темновой репарации. Дальнейшие исследования механизмов восстановления повреждений ДНК, вызванных ионизирующей радиацией и УФ-светом, оказало существенное влияние на развитие теории мутаций.

Повреждение УФ-светом структуры ДНК клеток в целом создает предпосылки для мутагенеза. Мутагенез, индуцированный УФ, является результатом ошибок репарации. Из-за низкой проникающей способности УФ применяется как мутаген для воздействия в основном на микроорганизмы, простейшие, пыльца растений, яйца насекомых и т.д. УФ-мутагенез используется для получения и последующего отбора новых штаммов микроорганизмов – продуцентов биологически активных веществ (Алиханян, Акифьев, Чернин, 1985; Клаг, Каммингс, 2009).

Применительно к человеку мутагенная активность УФ выражается в индукции соматических мутаций в клетках кожи. Возникновение клонов трансформированных клеток эпидермиса представляет собой один из этапов процесса возникновения опухоли. Существуют многочисленные эпидемиологические и экспериментальные доказательства канцерогенного действия

32

УФ-излучения. Установлен отчетливый рост заболеваемости раком кожи (базилиомой и плоскоклеточным раком) в направлении от полюсов Земли к экватору, с увеличением высоты стояния солнца над горизонтом, интенсивности инсоляции, числа ясных дней в году, доли УФ-компоненты в световом потоке. Рак кожи в 80-90 % случаев локализован на лице и других открытых частях тела. Наибольшая частота отмечена у лиц, постоянно находящихся под солнцем в силу своей профессии (моряки, скотоводы, геологи и др.). Все это подтверждает роль УФ-излучения в этиологии рака кожи у человека. С увеличением пигментации кожи заболеваемость раком кожи многократно снижается (Алтухов, 2003; Бочков, Чеботарев, 1989).

3.4. Механизмы действия химических мутагенов.

Впервые в науке еще в 30-х годах ХХ в. В.В. Сахаров (1932) и М.Е. Лобашев (1937) на примере аммиака и раствора иода показали, что химические вещества способны вызывать мутирование генов. Химические соединения, способные вызывать мутации у живых организмов, были названы мутагенами (Айала Ф., Кайгер, 1988; Ауэрбах, 1978).

Некоторые химические соединения изначально являются реакционноспособными мутагенами, непосредственно соединяющимися с молекулой ДНК и изменяющими ее химическую структуру. Другие химические вещества относятся к промутагенам, и для превращения в мутагены они проходят метаболическую активацию под действием ферментных систем клетки организма. При этом образуются реакционно-способные метаболиты, обладающие мутагенными свойствами.

Химические мутагены по способу действия на наследственные структуры можно классифицировать на 7 групп.

1.Окислители и восстановители.

2.Алкилирующие соединения.

3.Свободные радикалы.

4.Аналоги пуринов и пиримидинов.

5.Интеркалируюшие соединения.

6.Соединения, образующие аддукты с ДНК.

7.Соединения неорганической природы.

Данная классификация является условной. Например, аддуктами обычно называют продукты реакции присоединения. Поэтому в результате реакции алкилирования ДНК также образуются аддукты. Однако к соединениям, образующим аддукты с ДНК, обычно относят полициклические ароматические углеводороды, ароматические амины, афлатоксины и другие канцерогенные соединения, молекулярный вес которых выше, чем у азотистых оснований ДНК. Такие соединения способны образовывать объемные или «массивные» аддукты (Клаг, Каммингс, 2009).

33

Окислители и восстановители. Окисление обусловлено потерей атомом или молекулой электрона, а восстановление – приобретением электрона.

К мутагенам, вступающим в окислительно-восстановительные процессы, относятся азотистая кислота, фенолы, перекись водорода в присутствии формальдегида, йод и другие.

Реакции азотистой кислоты. Азотистая кислота (HNО2), проникая в клетки организмов, способна дезаминировать азотистые основания. Дезаминированию подвергаются аденин, гуанин и цитозин, в составе которых содержатся NH2-группы. Например, в результате дезаминирования аденин превращается в гипоксантин. В отличие от аденина гипоксантин приобретает способность спариваться с цитозином. При репликации ДНК это может привести к замене комплементарно спаренных А-Т на пару Г-Ц.

Реакции гидроксиламина. Гидроксиламин (NH2OH) как мутаген чаще используется в виде солянокислой формы NH2OH • НСl. В реакциях с ДНК in vitro гидроксиламин реагирует преимущественно с цитозином в нейтральной и кислой среде и с урацилом в щелочной среде. В процессе этих реакций может образовываться N-гидроокись цитозина, которая в отличие от цитозина способна комплементарно спариваться с аденином в процессе репликации ДНК. В результате пара Г-Ц может оказаться замещенной парой А-Т.

Алкилирующие соединения. Это наиболее обширная группа химических соединений, способных ковалентно присоединять алкильные радикалы к активным группам нуклеотидов в молекуле ДНК. Такой перенос алкильных групп на ДНК без участия ферментных систем называется реакцией алкилирования. Такой способностью обладают сернистый и азотистый иприты, лекарственные противоопухолевые препараты, (циклофосфамид, мелфалан), нитрозомочевины (кармустин, ломустин), а также алкилсульфонаты (бисульфан) и др. Алкилирующие агенты разделяются по типу переносимых алкильных групп: метильной, этильной или более сложной. Следствием реакций алкилирования чаще бывает выпадение из состава ДНК пуриновых оснований (депуринизация) и реже – пиримидиновых оснований.

Высокую мутационную способность алкилирующих соединений на примере этиленимина в 1939 г. доказал И.А. Рапопорт в СССР, а на примере иприта в 1940–1941 гг. аналогичное доказательство получили Ш. Ауэрбах и Дж. Робсон в Англии. И.А. Рапопорт также установил сильное мутагенное действие диалкил-сульфатов, эпоксидов и диазосоединений.

Нитрозосоединения представляют группу весьма эффективных химических мутагенов. Наиболее сильными из них являются N-нитрозо- этилмочевина, N-нитрозометилмочевина, N-нитрозоэтилуретан, N-метил-N'- нитро-N-нитрозогуанидин (МННГ) и другие.

34

Применение незначительных концентраций нитрозосоединений in vivo дает весьма высокий мутагенный эффект у различных видов живых организмов. По этой причине они были названы супермутагенами. Кроме мутагенного действия, нитрозосоединения способны вызывать канцерогенный эффект.

Свободные радикалы. Свободными радикалами называются атомы или фрагменты молекул, которые имеют отдельный неспаренный электрон, который придаёт радикалу необычную химическую агрессивность.

Свободные радикалы непрерывно образуются как побочные продукты клеточного метаболизма. При этом наряду с супероксидрадикалом (О2) возникают пероксид водорода (Н2О2) и особенно агрессивный гидроксилрадикал (ОН)., вызывающие повреждения в ДНК.

Аналоги оснований ДНК. К ним относятся производные пуринов и пиримидинов, обладающие достаточно высокой мутагенной активностью. Небулярин (пурин-D-рибозид), 5-бромурацил, 2-аминопурин, аминоптерин, производные фолиевой кислоты и другие способны замещать в молекулах нуклеиновых кислот нормальные азотистые основания.

Некоторые производные пуринов и пиримидинов могут выступать в разных таутомерных формах. Например, 5-бромурацил, в редкой энольной форме 5-бромурацил оказывается способным образовывать водородные связи не с аденином, а с гуанином. Таким образом, в новом цикле репликации в соответствующих точках пара А-Т замещается парой Г-Ц.

Интеркаляторы. Ряд химических красителей обладает способностью интеркалировать (встраиваться) между соседними основаниями ДНК, вызывая мутации со сдвигом рамки считывания. К таким красителям, например, относятся бромистый этидий и производные акридина.

Соединения, образующие аддукты с ДНК. Полициклические арома-

тические углеводороды, гетероциклические амины, афлатоксины и ряд других канцерогенных соединений в результате биотрансформации в организме млекопитающего образуют электрофильные реактанты, которые могут формировать объемные аддукты. Независимо от позиции, такой аддукт сильно нарушает комплементарное спаривание оснований между цепями и искажает спиральную структуру ДНК.

Мутации, индуцированные аддуктообразующими соединениями, преимущественно являются результатом ошибок репарации.

Соединения неорганической природы. Мутагенную активность прояв-

ляют соединения кадмия, хрома, никеля, свинца, ртути, мышьяка и др. Изучение механизмов индукции мутаций соединениями металлов показало, что двухвалентные катионы способны прямо взаимодействовать с ДНК, а металлы с переменной валентностью способны инициировать образование свободных радикалов кислорода, способных повреждать ДНК. Некоторые соединенияй металлов подавляют активность многих внутриклеточных ферментов, что мо-

35

жет привести к увеличению ошибок репарационных систем, обеспечивающих целостность ДНК (Абилев, Порошенко, 1986; Шигаева, 1994).

3.5. Биологические факторы, вызывающие мутации

Биологические факторы. Наряду с физическими и химическими мутагенами генетической активностью обладают также некоторые факторы биологической природы. Механизмы мутагенного эффекта этих факторов изучены наименее подробно. В конце 30-х годов С. М. Гершензоном начаты исследования мутагенеза у дрозофилы под действием экзогенной ДНК и вирусов. С тех пор установлен мутагенный эффект многих вирусных инфекций и для человека. Аберрации хромосом в соматических клетках вызывают вирусы оспы, кори, ветряной оспы, эпидемического паротита, гриппа, гепатита и др.

Повышение частоты хромосомных мутаций наблюдается при заражении крыс микоплазмой (Mycoplasma pulmonis). По данным Ю. Я. Керкиса, Н.Н. Ильинских и др., стрептолизин-О (токсин гемолитического стрептококка) увеличивает частоту мутаций в культуре эмбриональных фибробластов человека. Если в контроле наблюдалось, 4,0±0,5 % аберраций хромосом, то при воздействии стрептолизина-0 этот показатель повышался до 24,3±0,6 %. Выявлена генетическая активность (судя по числу хромосомных аберраций) заражения людей шигеллой (возбудитель дизентерии) и другими возбудителями инфекционных заболеваний.

Особого внимания заслуживает мутагенез под влиянием вакцинации. Благодаря введению живых вакцин достигнуты большие успехи в борьбе с опасными инфекциями: оспой, тифом, бруцеллёзом и др. В то же время широкое распространение вакцинации, охватывающей большое количество людей и нередко проводимой повторно, повышают опасность индукции мутаций. Частота хромосомных аномалий повышается и вследствие иммунологического стресса, вызываемого пересадкой и отторжением кожного лоскута, как это впервые показал для мышей Ю.Я. Керкис.

Рассматривая различные мутагенные факторы окружающей среды, следует принять во внимание, что они действуют не только по отдельности, но и во взаимодействии. Природный яд афлатоксин дает мутагенный эффект в результате метаболической активации в организме человека или после воздействия на него солнечного света (Инге-Вечтомов, 1989).

Тематика рефератов

1.Ионизирующие излучения и их биологическая активность.

2.Реакция клетки на действие ионизирующих излучений.

3.Поглощение энергии ионизирующих излучений и дозы излучения.

4.Мутагенная активность ионизирующих излучений.

36

5.Генетические последствия атомных бомбардировок Хиросимы и Нагасаки.

6.Итоги проекта «Грандиозная мышь».

7.Ультрафиолетовое излучение и его биологическая активность.

8.Реакция клетки на действие ультрафиолета.

9.Заболевания, вызываемые ультрафиолетом.

10.Использование алкилирующих соединений в селекции растений.

11.Супермутагены: характеристика и практика применения их в селекции.

12.Фреймшифт-мутагены: характеристика и распространение.

Контрольные вопросы и задания

1.Какие процессы лежат в основе поражения радиацией генетического аппарата клетки?

2.Как выражается зависимость частоты появления генных мутаций от дозы ионизирующего излучения?

3.В чем сущность понятия мишени в радиобиологии?

4.Как соотносятся принцип попадания с понятием мишени?

5.Чем отличается поглощенная доза от эффективной дозы облучения?

6.Какая разница между эквивалентной дозой и эффективной дозой облучения?

7.Что такое отдаленные последствия облучения?

8.Что такое радон?

9.Что такое относительная биологическая эффективность ионизирующего излучения?

10.Как соотносится относительная биологическая эффективность с линейной потерей энергии излучения?

11.Что характеризует линейная зависимость генетического эффекта от дозы облучения?

12.Что характеризует экспоненциальная зависимость генетического эффекта от дозы облучения?

13.Какова зависимость генетического эффекта радиации от мощности

ифракционирования дозы?

14.Какая разница имеется в величине потери энергии на единицу пути заряженной частицы разных видов излучений?

15.Восстанавливаются ли повреждения ДНК, индуцированные ионизирующими излучениями?

16.Чем отличаются детерминированные эффекты радиации от стохастических?

17.Какие результаты были получены в результате осуществления проекта «Грандиозная мышь»?

37

18.Что такое лучевая болезнь?

19.Почему чем больше промежуток времени между временем облучения и оплодотворением, тем меньшее количество мутаций вызывает радиация у потомства?

20.Чем отличаются отделенные последствия облучения от лучевой

болезни?

21.Какие вызывает димеры УФ в молекуле ДНК?

22.Какие повреждения в ДНК вызывает УФ?

23.Чем отличается УФ-свет от ионизирующего излучения.

24.Какова длина волны УФ-света, вызывающего повреждения в ДНК?

25.Вызывает ли УФ мутации в клетках человека?

26.Используется ли УФ в качестве мутагенного фактора?

27.Что такое темновая репарация? Как сейчас называют этот тип ре-

парации?

28.При какой реакции под влиянием азотистой кислоты пара аденинтимин может быть заменена на пару цитозин-гуанин?

29.Какие изменения производят алкилирующие соединения в двуспиральной молекуле ДНК?

30.Какие классы первичных повреждений ДНК возникают при действии химических мутагенов на хромосомы?

31.Что такое перекрестные сшивки в молекулу ДНК? Какова их роль в появлении мутаций?В чем состоит принцип действия аналогов оснований при репликации молекулы ДНК?

Вопросы для самостоятельной работы

1.Принцип попадания и концепция мишеней в радиобиологии.

2.Стохастические эффекты радиации.

3.Дозы радиации и виды лучевой болезни

4.Соединения металлов как мутагены.

5.Мутагенная активность свободных радикалов.

38

Глава 4. РЕПАРАЦИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК

Типы повреждений ДНК. Мутагенные химические соединения могут вызвать в ДНК одно- и двунитевые разрывы, сшивки ДНК-ДНК и ДНКбе- лок, ковалентно связанные с ДНК аддукты, различные повреждения оснований и сдвиг шага спирали ДНК в результате интеркаляции. Действие ультрафиолетового облучения приводит к образованию пиримидиновых димеров в ДНК. Ионизирующая радиация может вызвать разрыв пуринового кольца, фрагментацию основания, а также одно- и двунитевые разрывы ДНК. Активные формы кислорода (ОН·, О2–, Н2О2, перекиси липидов и др.), постоянно генерируемые в процессах метаболизма, повреждают и основания, и дезоксирибозу, что способствует образованию новых ковалентных связей (Дурнев, Середенин, 1998; Тарасов, 1994).

Алкилирование оснований может привести к его отрыву от ДНК, что образует беспуриновый или беспиримидиновый участок, который обычно называется АП-сайтом (участком). Включение посторонних оснований в АП-сайт приводит к мутациям (Жимулев, 2003).

Клетка способна устранить перечисленные повреждения несмотря на их различия и восстановить структуру ДНК. Процесс исправления ошибок в последовательности нуклеотидов ДНК и восстановление ее исходной структуры называется репарацией.

Системы репарации ДНК

Системы репарации ДНК достаточно консервативны в эволюции от бактерий до человека и наиболее изучены у Е. coli. Известны следующие типы репарации:

1)прямая репарация;

2)эксцизионная репарация;

3)репарация ошибок репликации ДНК;

4)рекомбинантная (пострепликативная) репарация;

5)SOS-репарация.

Прямая репарация. Прямая репарация – наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов.

1. Алкилированные основания ДНК исправляются без разрушения цепи ДНК О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазой, которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина. У Е.coli может в 1 мин синтезироваться до 100 молекул этого белка.

2. Апуриновые сайты могут репарироваться путем прямой вставки пуринов при участии ферментов, называемых ДНК-инсертазами.

3.Тиминовые димеры «расшиваются» путем прямой репарации при участии фотолиаз, осуществляющих соответствующее фотохимическое превращение. ДНК-фотолиазы представляют собой группу ферментов, активи-

39

руемых светом, с длиной волны 300–600 нм (видимая область), для чего в их структуре имеется особый светочувствительный центр. Они широко распространены в природе и обнаружены у бактерий, дрожжей, насекомых, рептилий, земноводных и человека.

Эксцизионная репарация (от англ. excision – вырезание) – большая часть структурных нарушений в ДНК устраняется вырезанием, которое осуществляют ферменты нуклеазы. Различают два типа эксцизионной репарации:

1.Эксцизионная репарация основания (baseexcisionrepair, BER) – удаление модифицированных и поврежденных оснований, АП-сайты и места с одноцепочечными разрывами в одиночку или вместе с окружением – участками цепи в 2–10 нуклеотидов. Первым этапом эксцизионной репарации является вырезание аномальных азотистых оснований. Его катализирует группа ДНК-N-гликозилаз, расщепляющих гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием.

Врезультате действия ДНК-N-гликозилаз образуется АП-сайт, который атакуется ферментом АП-эндонуклеазой. Она разрывает сахаро-фосфатный остов молекулы ДНК в АП-сайте и тем самым создает условия для работы следующего фермента – экзонуклеазы, которая последовательно отщепляет несколько нуклеотидов от поврежденного участка одной цепи ДНК. Образовавшаяся брешь застраивается нуклеотидами ДНК-полимеразой, ориентирующейся на вторую цепь ДНК (комплементарную). Окончательное сшивание репарированных участков осуществляет ДНК-лигаза.

2.Эксцизионная репарация нуклеотида (nucleotideexcisionrepair,NER.), которая задействована в случае более крупных повреждений – возникновения пиримидиновых димеров или других объемных образований в ДНК, нарушающих структуру спирали. При этом типе эксцизионной репарации вырезаются участки ДНК длиной в 30 нуклеотидов. Удаление фрагмента ДНК происходит по обе стороны поврежденного нуклеотида. Длина удаляемых олигонуклеотидных фрагментов отличается у прокариот и эукариот.

Выщепление фрагмента ДНК осуществляется ферментом эксинуклеазой (excinuclease). У Е. coli этот фермент состоит из 3 различных протомеров

– uvrA, uvrВ, uvrС, каждый из которых выполняет определенную функцию в ходе эксцизионного выщепления фрагмента ДНК. Название этих белков дано по первым буквам слов «ultraviolet repair». Протомер uvrА связывается с ДНК в виде димера, осуществляя первичное распознавание повреждения и связывание uvrВ. Протомер uvrВ обладает хеликазной активностью, необходимой для расплетания двойной спирали ДНК, и эндонуклеазной активностью, необходимой для расщепления фосфодиэфирной связи со стороны 3'-конца выщепляемого фрагмента. Протомер uvrС действует как эндонуклеаза, вносящая разрыв в репарируемую цепь ДНК с 5'-конца вырезаемого фрагмента. Выщепление фрагмента осуществляет экзонуклеаза uvrD. Образовавшаяся брешь в молекуле ДНК застраивается при участии ДНКполимеразы I и ДНК-лигазы.

40