мому колбы добавляют 1- 2 капли индикатора метилового оранжевого (1%- ный раствор) и нейтрализуют 10%-ным раствором едкого натрия до появления оранжево-желтого цвета.

Объем содержимого доводят до 200 мл и 3-кратным переворачиванием колбы перемешивают полученный 0,25%-ный раствор мёда. Определяют инвертированный сахар в данном растворе по указанной выше методике. Содержание сахарозы в мёде вычисляют по формуле:

С = (X −Y ) ×0,95

где С - содержание сахарозы в мёде, %;X-содержание инвертированного сахара после инверсии, %; У -содержание инвертированного сахара до инверсии.

23. Определение ядовитости мёда

Белым мышам подкожно вводят 1 мл 50%-ного раствора мёда. Если мёд токсичен, то уже в первые часы введения погибает до 75% животных, остальные - в течение суток. В качестве дополнительного метода, подтверждающего токсичность мёда, следует проводить пыльцовый анализ. Для этого необходимо знать морфологию пыльцовых зерен основных растений, из нектара которых пчелы делают ядовитый мёд.

24. Исследование мёда на остаточные количества антибиотиков

Исследования мёда на остаточные количества антибиотиков и обнаружение в нем возбудителей гнильцовых болезней проводят ветеринарные лаборатории, когда в ветеринарно-санитарном паспорте пасеки указано о неблагополучии ее по заразным болезням, обработке пчел антибиотиками и в случаяхотравления пчел.

52

Исследования также необходимы при проверке кормовых запасов пчелиных семей, идущих в зимовку.

В основе определения антибиотиков (стрептомицина, хлор, тетрациклина, неомицина и эритромицина) лежит принцип диффузии в агар. Отличие в их определении состоит в использовании различных тест-культур, сред и буфера.

Для определения стрептомицина необходимы: споры культуры Вас. subtilis штамм 6633, среда (раствор панкреатического гидролизата мясаперевар Хоттингера, содержащий 33 мг% аминного азота, двузамещенный фосфат натрия 2-3 г, агар-агар-20 г, рН 7,8-8,0) и буферный раствор (1/15 М фосфатный буфер с рН 7,8-8,0, состоящий из 11,612г, Na2HPO4 и 9,073 г Na2PO3). Для приготовления буферного раствора можно использовать соли калия. Каждую навеску соли отдельно растворяют в 100 мл дистиллированной воды в мерной колбе, а затем смешивают в соотношении: 9,5 части двузамещенного фосфата натрия и 0,5 части однозамещенного фосфата натрия.

Для определения хлортетрациклина необходимы: споры культуры Вас. subtilis штамм L2 среда (раствор панкреатического гидролизата мяса - перевар Хоттингера, содержащий 100 мг % аминного азота, агар-агар - 20 г, рН среды 6,1 - 6,2) и буферный раствор (цитратно-солянокислый Na, рН 5,0 - 5,2). Для приготовления буфера навеску лимоннокислого трех, замещенного натрия 8,6 г растворяют в 400500 мл дистиллированной воды. В этот же раствор добавляют 5,6 мл соляной кислоты (удельный вес 1,18- 1,19) и добавляют дистиллированной воды до 1000 мл. Все перемешивают и проверяют рН.

Для определения неомицина необходимы: споры культуры Вас. mycoides штамм 537; среда (раствор панкреатического гидролизата мяса, содержащий 33 мт % аминного азота, рН среды 7,8-8,0) и фосфатый буфер

53

7,8-8,0.

Для определения эритромицина необходимы: споры культуры Вас. mycoides штамм НВ; среда (раствор панкреатического гидролизата мяса, содержащий 33 мг % аминного азота, рН 7,8-8,0).

Стерильные чашки Петри диаметром 90-100 мм с ровным плоским дном устанавливают на столе по уровню. В расплавленную затем охлажденную до 45-48°С среду вносят взвесь спор той культуры, на какой антибиотик исследуют мёд, из расчета 20-30 млн. микробных тел на 1 мл среды. Среду со взвесью спор разливают по 10 мл в каждую чашку. После застывания агара на его поверхности на расстоянии около 28 мм от центра чашки вырезают 6 луночек тонкослойной стерильной трубкой с внешним диаметром 10 мм (для этой цели можно использовать трубку дляпробочников №

4).

Затем от исследуемой пробы в три пробирки берут по 1 г мёда. В зависимости от того, какой антибиотик определяют, испытуемую пробу разводят соответствующим буфером в соотношении 1:5 и прогревают наводяной бане при 60°С в течение 10 мин для устранения антибактериальных свойств мёда. После остывания содержимое пробирок вносят по 0,1 мл в две луночки от каждой навески (для исследования одной пробы используют одну чашку). Чашки переносят в термостат, где выдерживают 18-20 час при 37°С. По истечении указанного времени чашки просматривают. Наличие зоны угнетения вокруг луночек указывает на присутствие в мёде антибиотика. Такой мёд не допускается в продажу, он может быть использован в кондитерской промышленности, где применяют температурные режимы от 60 до 100°С в течение 1,5 ч.

Приготовление тест-культур

Ампулу с высушенным штаммом вскрывают и в нее стерильно добав-

54

ляют 0,5 мл дистиллированной воды. После полного растворения содержимое переносят пастеровской пипеткой в чашки Петри с 20%-ным мясопептонным агаром с рН 7,8-8,0 и 18-20 ч выращивают в термостате при температуре 37°С. Отбирают колонии с характерными признаками для необходимой культуры, высевают на скошенный в .пробирках 2%-ный мясопептонный агар и инкубируют 18-20 ч. Выращенную культуру смывают с поверхности агара и высевают в матрицы со средой, состоящей из 2,5% агара, приготовленного набульоне Хоттингера, содержащего 33 мг % аминного азота. Споры выращивают 10-12 суток при температуре 37°С. После обнаружения в мазках в поле зрения микроскопа 90-95% опор проводят смыв дистиллированной водой. Взвесь спор прогревают при температуре 6570°С в течение 30 мин и центрифугируют. Отмывание спор с последующим прогреванием проводят не менее 3 раз. Из основной взвеси готовят рабочую по стандартумутности 10.

Ампулы с высушенным штаммом тест-культур по заявкам поставляет Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов (Москва, Д-22, Звенигородское шоссе, 5).

55

25.Методы обнаружения возбудителей гнильцовых болезней вмёде

Для исследований необходимы люминесцентный микроскоп МЛ-2 с

набором прилагаемых к нему фильтров или обычный биологический микроскоп (МБИ-1, МБИ-3, МБИ-4), оборудованный специальным люминесцентным устройством; осветитель для возбуждения люминесценциипрепарата (источником света служит ртутная лампа СВД-250); светофильтры СС- 4, СС-8, опак-иллюминатор ОЙ-17 или ОЙ-18, предметные и покровные обезжиренные стекла, флуоресцирующие антиларвейные и антиальвейные сыворотки и контрольная кроличья люминесцирующая сыворотка, спирт этиловый и метиловый, забуференный физиологический раствор (фосфатный буфер); забуференный глицериновый раствор, нефлуоресцирующее иммерсионное масло, иммерсионные жидкости, при отсутствии их можно использовать диметилфталат.

Глицериновый буфер готовят смешиванием девяти частей нейтрального глицерина и одной части фосфатного буфера с рН 8,0.

Препарат фиксируют этиловым или метиловым спиртом, промывают фосфатным буфером с рН 7,4. Последний готовят путем смешивания 30 мл Г/15 М раствора однозамещенного фосфорнокислого натрия или калия, 120 мл 1/15 М раствора двузамещенного фосфорнокислого натрия и 8,78 г хлористого натрия в 1 л дистиллированной воды. Жидкий мёд предварительно тщательно перемешивают и берут пробу. Пробы из засахаренного мёда отбирают щупом с разной глубины; от сотового мёда берут пробу весом 30 г и, удаляя забрус, погружают в 15-20 мл стерильного физиологического раствора для полного растворения мёда в ячейках сотов.

Навеску мёда 15-20 г помещают в стерильную колбочку и добавл яют 2530 мл стерильного физиологического раствора (температура 35-40ºС). Растворенный мёд центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин.

56

Надосадочную жидкость осторожно сливают, к центрифугату опять добавляют 25-30 мл стерильного физиологического раствора, взбалтывают и еще раз центрифугируют. Из полученного центрифугата параллельно делают два мазка, один из которых окрашивают по Граму, другой на споры-2%- ным раствором карболового фуксина. Для обнаружения Вас. larvae центрифугат высевают на мясо-пептонный сывороточный агар (среда Томашеца) и для Вас. alvei, streptoe, apis- на МПА и МПБ. Выросшую культуру возбудителя идентифицируют согласно общепринятым бактериологическим методам.

В тех случаях, когда из-за низкой плотности инфицирования мёда бактериологическим методом выделить возбудителей нельзя, можно применять метод флуоресцирующих антител с использованием антиларвейной и антиальвейной сывороток.

Для этой цели используют следующую методику: 15-20 г мёда растворяют в 25-30 мл физиологического раствора ицентрифугируют. Из центрифугатов делают мазки, фиксируют этиловым спиртом в течение 15 мин, высушивают на воздухе, затем увлажняют фосфатным буфером с рН 7,4 и опять высушивают. Препараты окрашивают прямым способом. Для этого на мазок наносят каплю соответствующей флуоресцирующей сыворотки, помещают в чашку Петри с влажным тампоном ваты и выдерживают при Температуре 37°С в точение35-45 мин. Окрашенные мазкипромывают тем же буферным раствором, дважды сменяя раствор через 20 мин, и ополаскивают дистиллированной водой. На высушенные мазки помещают каплю буферного глицерина, покрывают тонким покровным стеклом, на которое наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом МЛ-2 по общепринятой методике.

Сыворотки по заявке поставляет Украинский научно-

57

исследовательский институт экспериментальной ветеринарии.

Степень свечения микробных клеток оценивают по четырехбалльной системе:

+ + + + - сияющее золостисто-зеленоватое свечение палочек и спор Вас. larvae с ярко выраженнымиконтурами микробных клеток; +++- яркое зеленоватое свечение палочек и спор с четко выраженнымиконтурами; + +

-умеренное зеленовато-желтоватоесвечение клеток

испор с отчетливыми контурами; +- слабое сероватое свечение микробныхклеток испор с неяснымиконтурами;

- - клетки незаметны или в виде серых теней. Оценивают степень свечения большинства клеток. В контроле с чистой культурой Вас. larvae, окрашенной флуоресцирующей антиларвейной сывороткой, свечение должно быть ( + + + + ); при окраске препаратов, приготовленных из центрифугатов мёда антиальвейной флуоресцирующей сывороткой, свечение должно быть (+ + ) и( + ).

Мёд, инфицированный возбудителями гнильцовых болезней пчел, после автоклавирования при температуре 120°С в течение 20 мин может быть использован для кормления пчел или его направляют в кондитерскую промышленность.

26. Определение частоты встречаемости пыльцевых зерен (ГОСТ Р

52940-2008)

Определение частоты встречаемости пыльцевых зерен проводят согласно ГОСТ Р 52940-2008 “Мед. Метод определения частоты встречаемости пыльцевых зерен”.

Частота встречаемости пыльцевых зерен (relative frequenciesofthe pollen) - доля пыльцевых зерен отдельного вида, выраженная в процентах от общего числа учитываемых пыльцевых зерен.

58

Сущность метода. Пыльцевые зерна концентрируют из раствора меда центрифугированием, готовят препарат для световой микроскопии, идентифицируют определенное количество пыльцевых зерен и вычисляют процентную долю пыльцевых зерен отдельных видов от общего числа учтенных пыльцевых зерен.

Отбор и подготовка пробы. Репрезентативную пробу меда массой не менее 200 г отбирают по ГОСТ Р 52451, ГОСТ 19792. Закристаллизованный мед размягчают в термостате по 6в или на термостатируемой водяной бане.

Мед с примесями процеживают через сито по ГОСТ Р 51568. Крупные механические частицы удаляют вручную.

Сотовый мед (без перговых ячеек) отделяют от сот при помощи сита без нагревания. Пробу интенсивно и тщательно перевешивают не менее 3 мин.

Средства измерения, вспомогательные устройства и материа-

лы. Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более 0.01 г. Дозатор пилеточный или механический одноканальный с объемом дозирования до 1 см3 или пипетка стеклянная градуированная номинальной вместимостью 1,0 см3 по ГОСТ 29227 (Рекомендуется применять дозатор со сменным наконечником, чтобы избежать попадания в препарат пыльцы из других образцов меда). Цилиндр мерный стеклянный вместимостью 50-100 см3 по ГОСТ 1770. 64 Микроскоп световой общего назначения, микроскоп биологический с увеличением 300×-1000×. Центрифуга, позволяющая получать центростремительное ускорение 1000 g. Сито из нержавеющей стали, диаметр отверстий 0.5 мм по ГОСТ Р 51568. Водяная баня. Термостат или другое устройство, позволяющее

59

производить равномерный нагрев до 40ºС. Пробирки стеклянные центрифужные вместимостью не менее 40 см3 по ГОСТ 25336. Стекло предметное по ГОСТ 9284. Стекло покровное по ГОСТ 6672. Стакан стеклянный номинальной вместимостью 50-100 см3 по ГОСТ 25336.

Допускается использование других средств измерении и лабораторного оборудования по метрологическим, техническим характеристикам и качеству не нижеуказанных.

Реактивы. Глицериновый желатин для микроскопии или глицериновый желатин, приготовленный как описано ниже.

Глицерин по ГОСТ6259,ч. (Рекомендуется использовать глицериновый желатин указанной марки, так как осмотические свойства среды заключения влияют на морфологию и достоверность идентификации пыльцевых зерен). Желатин пищевой по ГОСТ 11293. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709. Фенол по ГОСТ 23519.

Допускается использование других реактивов по качеству и чистоте не ниже указанных.

Проведение испытаний.

Подготовка к испытаниям. Глицериновый желатин готовят следующим образом. 10 г желатина по ГОСТ 11293 заливают 60смэ дистиллированной воды по ГОСТ 6709 и выдерживают 2-3 ч для набух ания (смесь 1); в 70 см3 глицерина по ГОСТ 6259 растворяют 0,1 г фенола по ГОСТ 23619, вливают в смесь 1 и, перемешивая, нагревают на водяной бане до образования однородной массы. При этом следует избегать попадания в глицериновый желатин пузырьков воздуха.

Приготовление препарата меда. В стакане по ГОСТ 25336 взве-

шивают (10.0 ± 0.1) г меда, подготовленного как описано в подразделе “Отбор и подготовка пробы”, растворяют в 20 см3, дистиллированной

60

воды, нагретой до температуры не выше 40 ºС, и переносят в центрифужную пробирку по ГОСТ 25336 Раствор центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 1000 д.

Надосадочную жидкость осторожно сливают, к осадку добавляют 20 см3 дистиллированной воды и перемешивают. Полученную суспензию центрифугируют 5 мин при 1000 g. Надосадочную жидкость декантируют, центрифужную пробирку помещают на фильтровальную бумагу под углом 45º для удаления остатков жидкости.

Осадок тщательно перемешивают микробиологической петлей или с помощью дозатора со сменным наконечником, переносят на предварительно прогретое до 40 ºС предметное стекло по ГОСТ 9284 и равномерно распределяют по площади 22 × 22 мм микрошпателем или гранью покровного стекла по ГОСТ 6672. Стекло с осадком прогревают при температуре не выше 40 ºС до полного высушивания осадка.

Глицериновый желатин расплавляют на водяной бане при температуре не выше 40 ºС. На предварительно прогретое до температуры 40 ºС покровное стекло наносят каплю глицеринового желатина и распределяют крестообразно по диагоналям. Покровное стекло медленно (во избежание появления воздушных пузырьков) опускают на подсушенный осадок. Для равномерного распределения глицеринового желатина и оптимального набухания пыльцы препарат прогревают в течение 5 мин при температуре не выше 40 ºС. Глицериновый желатин нельзя наносить непосредственно на высохший осадок.

Просмотр препарата под микроскопом проводят после застывания глицеринового желатина.

Если в препарате обнаружена низкая плотность пыльцевых зерен, то его готовят вновь из большего количества меда, сохраняя при этом

61

пропорции, указанные в подразделе “приготовление препарата меда” В случае высокого содержания пыльцы препарат готовят на части

осадка, полученного, как описано выше в подразделе “приготовление препарата меда”. Для этого пипеткой по ГОСТ 29227 ил и дозатором перемешивают осадок в центрифужной пробирке с 0,5-1,0см3 воды Необходимое количество суспензии равномерно распределяют по предметному стеклу и высушивают.

Подсчет пыльцевых зерен

При предварительном просмотре под микроскопом оценивают плотность и разнообразие пыльцевых зерен в препарате, проводят идентификацию присутствующих морфологических типов пыльцевых зерен. Увеличение микроскопа должно быть достаточным для достоверной идентификации.

При подсчете пыльцевых зерен подбирают такое увеличение микроскопа, чтобы их число в каждом поле зрения было счетным. Скопления пыльцевых зерен, которые относятся к перге, не учитывают.

Поля зрения, в которых проводят подсчет (счетные поля), должны быть, по возможности, равномерно распределены по рядам. При смене счетного поля, во избежание субъективного выбора, препарат рекомендуется перемещать без наблюдения в окуляр микроскопа. Интервал между счетными полями зависит от плотности пыльцевых зерен в препарате. В случае анализа меда с низким содержанием пыльцы следует подсчитывать одну непрерывную линию.

По каждому ряду подсчитывают не менее 100 пыльцевых зерен. Первые пять рядов распределяют равномерно по площади препарата, как изображено на рисунке 1. Таким образом, сумма подсчитанных пыльцевых зерен должна составлять не менее 500.

62

В каждом счетном поле подсчитывают количество пыльцевых зерен искомого(ых) вида(ов) растений приведенных в приложении, а также общее количество пыльцевых зерен не принадлежащих:

-всем видам растений:

-видам растений, выделяющих нектар, без подсчета пыльцевых зерен видов, не выделяющих нектар (перечень не выделяющих нектар растений приведен в приложении № 5;

-видов растений, выделяющих нектар, без подсчета пыльцевых зерен отдельного(ых) вида(ов).

Рисунок 1 - Схема расположения статных полай при подсчете пыльцевых зерен под микроскопом

Вариант подсчета числа пыльцевых зерен выбирает исполнитель в зависимости от целей исследований.

Если для интерпретации результатов недостаточно 500 учтенных пыльцевых зерен, следует подсчитывать не менее 1000 пыльцевых зерен. Для этого дополнительные пять рядов счетных полей размещают между первыми пятью рядами, как изображено на рисунке 1.

63

Обработка и представление результатов испытаний

Частоту встречаемости пыльцевых зерен отдельного вида растений Хр. %, рассчитывают по формуле:

Хр = A×100n−1 ,

где А = ΣА j - число пыльцевых зерен отдельного вида во всех счетных по-

лях:

n = Σnj - общее количество подсчитанных пыльцевых зерен во всех счетных полях; 100 - коэффициент пересчета относительных долей в проценты.

При представлении результатов испытаний относительно пыльцевых зерен видов растений, выделяющих нектар, следует указать частоту встречаемости этих пыльцевых зерен относительно общего количества пыльцевых зерен всех видов.

За результат испытаний принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, полученных в условиях повторяемости, если расхождение между ними не превышает предел повторяемости r по ГОСТ Р ИСО 5 725-6. Значение предела повторяемости r приведено в таблице 9.

При превышении предела повторяемости r целесообразно произвести дополнительное определение частоты встречаемости пыльцевых зерен и получить еще один результат. Если при этом расхождение (X P. max − X P. min ) результатов трех определений не превосходит значения критического диапазона GR0,95 , то в качестве окончательного результата принимают среднеарифметическое значение результатов трех определений. Значение критического диапазона GR0,95 , приведено в таблице

9.

64

При невыполнении этого условия проводят повторные испытания. Расхождение между результатами испытаний, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости R по ГОСТ Р ИСО 5725-6. При выполнении этого условия приемлемы оба результата испытания и в качестве окончательного результата может быть использовано их среднеарифметическое значение. Значение

предела воспроизводимости R приведено в таблице 9.

Таблица 9 - Значение критического диапазона GR0,95

Результат испытаний представляют в виде значения, округленного до сотых долей в диапазоне частоты встречаемости от 0.1 % до 1,0 %; десятых долей - от 1,0 % до 10,0 %; целых чисел - от 10,0% до 100,0 %.

Пример определения числа пыльцевых зерен, частоты встречаемости пыльцевых зерен отдельных видов представлен в приложении № 6 примеры расчета повторяемости и воспроизводимости при определении частоты встречаемости пыльцевых зерен - в приложении № 6.

Характеристика погрешности испытаний

Погрешность результатов испытаний, получаемых согласно данному методу, не превышает 0,21 X−P , при доверительной вероятности Р- 0,95.

Результаты испытания оформляют протоколом в соответствии с требованиями ГОСТ РИСО/МЭК17025.

65