Сортоводство древесных растений. Учебное пособие

Рассмотрим факторы, оказывающие большое значение на успешное проведение работ по клональному размножению.

1. Эксплант.

Из всех факторов, определяющих успех клонального микроразмножения, наибольшее значение имеет генотип исходного растения. Двудольные травянистые растения имеют более выраженную способность к индукции заложения адвентивных почек, росту побегов, укоренению и в конечном итоге получению более высокого коэффициента размножения, чем ткани и органы однодольных травянистых и тем более древесных растений.

Существенно влияют родовые, сортовые и формовые особенности исходного экспланта. Так выделяются формы ели обыкновенной с четко выраженной мутовчатостью или отсутствующей мутовчатостью. Из изолированных зародышей у 1-й группы образовались адвентивные почки у 62 % эксплантов, у 2-й – только 28 %.

На процесс возникновения, формирования и развития органов (органогенез) у потомства и его генетическую стабильность значительное влияние оказывает размер экспланта. Чем меньше эксплант, тем меньшей регенерационной способностью он обладает (но в крупном экспланте увеличивается возможность появления в его клетках вирусов). Оптимальная величина экспланта зависит от видовых особенностей растений (для малины – 2 мм, хмеля – 0,1–0,2 мм, лука,

чеснока – 0,5–0,8 мм).

Физиологический возраст экспланта. Лучше регенерируют зре-

лые зародыши и 20–30-дневные проростки (ювенильный материал) или их части, например, из одного изолированного зародыша лиственной древесной породы можно получить до 100 тыс. растений за год, а из почек взрослого растения – в 100 раз меньше. Зародыши сосны могут образовывать адвентивные почки в 67 % случаев, 20–30-дневные проростки – 48 %, 2-летний материал – 10 %, 5-летний – 2–3 %, 15-летний – 0 %. К тому же на тканях и органах взрослых растений через 2–3 пересадки образуются «отмершие» участки, которые ведут к гибели экспланта.

У растения эхеверии на эксплантах из молодых листьев возникают только корни, из старых листьев – только побеги, а из средних по возрасту листьев – корни и побеги.

Время изолирования экспланта (экспланты, изолированные в фазу активного роста, более склонны к укоренению и развитию побегов по сравнению с эксплантами, изолированными в фазу покоя). Так, для осины процент почек, способных развиваться в побеги, при

41

изолировании их в январе был 21,1–42,2 %, мае – 43,2–85,6 %, октяб-

ре – 29,8–47,6 %.

2. Физические факторы выращивания.

При выращивании эксплантов предъявляются следующие требования.

Температура. Тепловой режим зависит от вида растения и культивируемой ткани. Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей составляет 25–26 °С, для культуры тканей тропических растений – 29–30 °С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18–20 °С. Оптимальная температура для культуры корней у двудольных – 25–27 °С, у однодольных – 20–25 °С, голосеменных – 18–20 °С. Древесина ветвей хвойных регенерирует при 25 °С, хвоя – при 23–24 °С. Листья (на примере тополя) – при температуре 21–23 °С. Культура зародышей успешна при температуре 25–30 °С.

У некоторых видов растений температура влияет на тип морфогенеза: у фаленопсиса при температуре 28 °С из почек регенерируют вегетативные побеги, а при 20 °С – генеративные.

Свет. Изолированные ткани растений выращивают при той интенсивности освещения, к которой привычно материнское растение. Однако свет не всегда является необходимым для выращивания культур in vitrо. Например, культуру корней можно выращивать в темноте. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как не имеет хлоропластов и питается гетеротрофно, их выращивают в темноте или при рассеянном свете, а для успешного морфогенеза их переносят в помещение с интенсивным освещением (1000–4000 лк). Исключение составляют зеленые каллусные ткани (например, ткань мандрагоры). Каллусная ткань растет лучше при облучении красным или обычным светом. При ультрафиолетовом облучении ткань становится водянистой.

Зеленые ткани растений целесообразно выращивать на свету. На первых этапах клонального размножения оптимальная интенсивность освещения для большинства растений составляет 1000–3000 лк. Продолжительность освещения, в основном, 14–16 ч в сутки. При подготовке растений к переносу в почву интенсивность освещения повышают, как правило, до 10000 лк.

Прямой солнечный свет тормозит рост тканей и вызывает нек-

розы.

На интенсивность и характер роста изолированных тканей влияет и спектральный состав света. У берёзы при красном свете укоренение микрочеренков около 100 %, при белом – несколько меньше,

42

при синем – только у половины черенков образуются корни, в темноте – еще меньше. У ткани табака красный свет вызывает образование цветочных почек, фиолетовый и ультрафиолетовый свет – адвентивные почки (в каллусе), а темнота стимулирует образование корней. У подсолнечника более интенсивно стимулирует образование почек белый, красный и голубой свет, чем зелёный.

Влажность воздуха. Относительная влажность воздуха в камерах для выращивания культур in vitrо обычно поддерживается на уровне 65–75 %. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в комнате можно использовать поддоны с водой. При пересадке в почву размноженные в пробирках растения нуждаются в повышенной влажности, что достигается созданием в камерах атмосферы «тумана» (около 80 %).

3. Стерильность.

Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является строгое соблюдение стерильности. Богатая питательная среда – прекрасный субстрат для развития в ней микроорганизмов. Поэтому необходимо стерилизовать эксплант, культуральное оборудование и питательную среду.

Инфекция, наблюдаемая в культурах растительных тканей, может быть систематической и случайной. В первом случае необходимо проанализировать все операции подготовки, стерилизации среды, тканей, помещений, чтобы обнаружить ошибку, определяющую эту систематическую инфекцию.

От тщательности подготовки стерильных условий работы и стерильности самого эксплантата, при правильном подборе питательных сред, на 90 % зависит успех эксперимента.

4. Питательная среда.

Одним из основных факторов, влияющих на процесс вегетативного размножения in vitro, является правильный подбор питательной среды.

Консистенция питательной среды. Существуют способы выращивания изолированных тканей.

1. На поверхности полутвердой агаровой питательной среды. Основное преимущество данного способа состоит в том, что

ткань, находясь в воздухе, хорошо аэрируется, что очень важно для роста культуры. Также использование твёрдых сред способствует преодолению витрификации (появлению аномальных побегов).

43

Недостатком этого метода выращивания является то, что ткань хуже снабжается питательными веществами, и плохо удаляются токсические вещества, образующиеся в ходе роста ткани.

2. Погруженными в жидкую среду.

Считается, что в жидких питательных средах стимулируется рост ткани, сокращается период выращивания и число пассажей. Однако возрастает вероятность образования аномальных (витрифицированных) побегов и становится проблемой создание хорошей аэрации.

По способу обеспечения аэрации второй метод может быть разделен на 3 группы:

а) выращивание ткани на фильтре, погруженного концами в жидкую питательную среду. Этот способ мало применяется в настоящее время, так как обладает недостатками первого метода;

б) выращивание ткани, погруженной в жидкую питательную среду на качалках и роллерах. При этом культуральные сосуды представляют собой запаянные с двух сторон цилиндры с боковым отводом, через который в сосуд вводится ткань. Горловина отвода закрыта ватной пробкой и колпачком из целлофана. При вращении дисков сосуды поворачиваются, и ткань погружается в питательную среду, затем, при повороте диска на 180°, она остается на стенке сосуда в его верхней части. Недостаток подобных аппаратов в том, что они небольшого объема. Это не позволяет выращивать большие массы тканей и суспензий;

в) выращивание тканей с продуванием жидкой среды воздухом. Кислотность среды. Этот фактор определяет для растений доступность питательных веществ. Сильнокислые или, наоборот, щелочные среды лимитируют поступление некоторых элементов (фосфора, железа), делая их плохо растворимыми. Также при большой кислотности эти элементы могут переходить в растворенное со-

стояние и становиться токсичными для эксплантов.

Растительные ткани рекомендуют культивировать на среде с рН, соответствующей кислотности почвы, на которых произрастают эти виды в естественных условиях (для ели – более кислые, для лиственницы – более щелочные и т. п.). Чаще всего значение данного показателя доводится до 5,6–5,8. У ели оптимальное значение рН равно 5,2–5,6. У сосны – 5,2. При рН = 4,7 у сосны способность зародышей образовывать адвентивные почки понижается в 2,5–3 раза.

Состав питательной среды является одним из основных факторов, влияющих на процесс вегетативного размножения in vitro.

44

Питательная среда должна включать такой набор веществ и в таких пропорциях, которые обеспечивают деление и рост размножаемой ткани. Любая питательная среда для выращивания культуры изолированной растительной ткани включает в свой состав следующие большие группы веществ: минеральные соли, макро- и микроэлементы, углеродное питание, витамины, аминокислоты, стимуляторы роста (синтетического и натурального происхождения), агар (в случае выращивания тканей на твердой среде), вода (как правило, бидистиллированная).

Минеральное питание

Макроэлементы. Хеллер в 1953 г. пришел к выводу, что отсутствие в питательной среде азота, калия, кальция, магния, серы, фосфора приводит к гибели культуры. Наличие натрия и хлора не является обязательным, хотя иногда стимулирует рост тканей.

Потребность ткани в элементах минерального питания зависит от ее физиологических особенностей: для быстрорастущих молодых тканей необходимо присутствие в среде больших доз калия; старые ткани требовательны к присутствию кальция.

Микроэлементы. Отсутствие микроэлементов уменьшает интенсивность роста на 40 % и в последующем приводит к гибели культуры. Внесение в питательную среду раствора микроэлементов особенно важно при культивировании тканей в жидкой среде.

Углеродное питание

В качестве источников углеродного питания могут применяться сахара, спирты и органические кислоты. Лучше всего для этих целей использовать сахара. Способность ткани усваивать те или иные сахара зависит от ее происхождения. Например, для ткани моркови лучшим источником углеродного питания является сахароза, затем глюкоза, мальтоза, раффиноза, фруктоза и т. д., а вот для ткани секвойи лучшей считается фруктоза.

Рост культур обычно прекращается при повышении концентрации сахара до 6–8 %. Сахарозу чаще всего используют в концентрации 3 %. Но для зародышей ели обыкновенной при такой высокой концентрации сахарозы уже на втором пассаже наблюдается гибель всех эксплантов (в данном случае оптимальная концентрация составляет 0,5–1 %). А для корня сахарной свеклы, который в естественных условиях накапливает много сахара, – 10 % (может расти даже при 20 %). Для кокосовой и финиковой пальм – 14 %, кактуса – 10 %, кукурузы – 8 %.

45

Из спиртов в качестве единственного источника углеродного питания может использоваться только глицерин. Такие спирты, как метанол, этанол, глицерин (в концентрации до 0,5 %) можно добавлять к сахарам. В таком случае они стимулируют рост ткани. Пропанол и бутанол токсичны в любых концентрациях.

Органические кислоты хуже используются тканями растений.

Витамины

Большинство тканей, культивируемых in vitro, способны к синтезу всех нужных для их жизнедеятельности витаминов. Однако при внесении витаминов в питательную среду рост ткани улучшается. Наиболее важную роль в росте культуры тканей играют витамины групп В. Для улучшения роста культур изолированных тканей к среде обычно добавляют смесь из трех витаминов, а именно В1, В6 и никотиновой кислоты, предложенную Уайтом для выращивания корней.

Для тканей древесных растений применяют смесь из 8 витаминов, предложенную Жакио: витамин В1; пантотенат Са; биотин; мезоинозит; рибофлавин; никотиновая кислота; парааминобензойная кислота; фолиевая кислота.

Стимуляторы роста – физиологически активные вещества, стимулирующие процессы роста и развития растений (ауксины, гиббереллины, цитокинины).

Ауксины – вещества, стимулирующие рост стеблей, листьев и корней; гиббереллины – вещества, ускоряющие деление клеток в зоне, непосредственно примыкающей к верхушке стебля, и способствующие его удлинению; цитокинины – вещества, активизирующие деление клеток, участвующие в образовании стеблей и корней, дифференциации новых органов.

Наиболее часто при микроклональном размножении применяют цитокинины (кинетин, БАП и др.), ауксины (ИУК, НУК и др.). Иногда добавляют гибберелловую кислоту, которая стимулирует рост и вытягивание (элонгацию) сформировавшихся почек и способствует получению растений с хорошо развитой надземной частью.

Также в качестве стимуляторов роста широко применяют солодовый, дрожжевой экстракты, томатный, апельсиновый и арбузный соки, эндоспермы из незрелых плодов и семян растений. Наибольшим стимулирующим действием обладают незрелые эндоспермы семян растений. Экстракты из молодых растущих органов и частей растений стимулируют, а из зрелых семян и органов, находящихся в стадии покоя, угнетают рост тканей.

46

Без добавления к питательной среде стимулирующих веществ в культуре способны расти только опухолевые ткани и камбиальные ткани некоторых видов (моркови, ивы). Однако нужно помнить, что при высокой гормональной насыщенности среды возможно угнетение роста ткани вплоть до гибели.

Культуру тканей и органов растений используют при сортовыведении растений для преодоления прогамной и постгамной несовместимости (табл. 2.2).

Таблица 2.2

Использование культуры in vitro при сортовыведении растений

Оздоровление посадочного материала. Вирусные болезни растений приводят к выпадению ценных сортов. Для оздоровления посадочного материала применяются методы термотерапии и хемотерапии. В последнее время для этой цели рекомендуется использовать метод культуры меристемы стебля растений.

Как правило, меристема состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листовых зачатков и является свободной от инфекции. Зона, свободная от вирусов, зависит от вида и сорта растения, вида вируса.

Трудность использования меристемы стебля для получения свободных от вирусов растений заключается в том, что верхушка стебля величиной 0,5 мм (500 мк) и больше легко укореняется и превращается в целое растение, но не всегда бывает свободной от всех вирусов, а кусочки в 100–200 мк трудно укоренить и подобрать для них нужную питательную среду.

Получение здоровых растений в культуре ткани полезно сочетать с другими методами оздоровления растений, т. е. с термо- и хемотерапией. В последнее время ученые зачастую комбинируют эти способы.

47

При хемотерапии ингибиторы размножения вирусов добавляют в состав питательной среды или вводят их в растение. При использовании вирозола (противовирусного препарата широкого спектра действия) количество безвирусных меристемных растений увеличивалось до 80–100 % при 0–41 % в контроле. Положительные результаты хемотерапии были получены для сливы, черешни, малины и др.

При термотерапии пробирки с меристемой помещают в освещенное место, где в течение первой недели повышают температуру от 25 до 37 °С путем ежедневного ее увеличения на 2 °С. Продолжительность термотерапии зависит от состава вирусов и их термостойкости. Существуют растения (луковичные, розы и др.), рост которых угнетается в результате длительной термотерапии.

Кроме положительного действия термотерапии на освобождение растений от вирусов, выявлено увеличение коэффициентов размножения на 50–60 %, повышение адаптации пробирочных растенийрегенерантов к почвенным условиям.

Через 20–30 дней в некоторых пробирках из меристемы вырастает побег. Побег длиной 3–4 см режут на фрагменты в 0,5–1,0 см; каждый из них должен иметь листочек и пазушную почку, а потом пересаживают на питательную среду того же состава для укоренения.

Часто вызывает трудности перенос образовавших корни растений

впочву. Для успешного решения этой проблемы часто применяются прививки полученных стеблевых побегов на близкие виды растений. При этом желательно в качестве подвоя использовать растение, которое может служить индикатором для обнаружения вирусных частиц

впривое. В институте физиологии растений им. Тимирязева в Москве для оздоровления цитрусовых растений от вирусных и микоплазменных заболеваний применяется метод микропрививок в культуре in vitro. В качестве подвоя используются двухнедельные сеянцы трифолиаты. У них отрезают верхнюю часть побега, оставляя 1–1,5 см надсемядольного колена; укорачивают корни до 4–6 см; удаляют семядольные листья и пазушные почки. После этого в верхней части сеянца

делают перевернутый Т-образный разрез вниз по стеблю (1 × 1 мм). В качестве привоя используют изолированные верхушки побегов тепличных растений лимона и апельсина и др. Части побегов размером 0,14–0,18 мм помещали под кору разреза корневого подвоя так, чтобы они основанием соприкасались с камбием подвоя. Привитые растения выращивают на жидкой питательной среде. Через две недели образуются первые листья. Через месяц формируется не менее двух листьев, и растения пересаживают в почву. Процент живых составляет более 90.

48

Факторы, влияющие на регенерацию растений из меристем:

1)срок вычленения меристем;

2)сортовые особенности;

3)размер меристем;

4)питательная среда.

Впоследнее время пытаются извлекать меристемы не только из кончика стебля, но и из других частей растений. При сравнении различных методов оздоровления растений выявлено, что при вычленении меристем из пазушных почек получен наиболее высокий выход здоровых растений (36 %) и более высокая приживаемость меристем. При вычленении меристем из этиолированных ростков выход безвирусных растений составляет 23,2 %. Применение метода каллусных культур позволяет получить 7,4 % растений, свободных от вируса. Меристема кончика корня также свободна от вирусных частиц, но из нее обычно невозможно получить целого растения. В литературе описано всего два случая, когда удалось наблюдать возникновение стеблевой почки и регенерацию целого растения из корневой ткани.

Метод культуры меристемы находит все более широкое применение для оздоровления посадочного материала. Во Франции метод культуры меристемы нашел широкое распространение в хозяйствах, где оздоравливают декоративные растения – гвоздики, орхидеи.

ВЛатвии у 109 сортов хризантем проводили термотерапию при

температуре 37±1 °С. Затем девять термически обработанных сортов хризантем размножили меристемным методом. В Москве оздоравливали три сорта малины (Латам, Карнавал и Оттава), при этом с отросших при повышенных температурах (35 °С) в течение 40–120 дней побегов срезали верхушки длиной 1–2 мм и выращивали в пробирке на среде Мореля с добавлением ИМК (0,05 мг/л). При этом с оздоровленных растений урожай был выше на 20 %.

Здоровые растения, полученные в культуре ткани, размножают на участках, где обеспечена защита от вирусов.

2.3. ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ВЫРАЩИВАНИЯ СОРТОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА ПРИ СЕМЕННОМ РАЗМНОЖЕНИИ

Интенсификация выращивания посадочного материала ведется с использованием удобрений, микроэлементов, стимуляторов роста и других биологически активных веществ.

Известно, что растения для ростовых процессов нуждаются в больших количествах азота, фосфора, калия, кальция, магния, а также наличии микроэлементов в легкоусвояемой форме.

49

К микроэлементам, оказывающим стимулирующее воздействие, повышение устойчивости растений к болезням, относятся бор, медь, марганец, кобальт, цинк, алюминий и др.

И. В. Мичурин в 1924 г. отмечал стимулирование роста сеянцев миндаля «Посредник» 0,02%-м раствором KMnO4. Однолетние сеянцы этого сорта, обработанные раствором KMnO4, имели высоту 180 см, а на второй год цвели и плодоносили, в то время как в контроле они достигли этой высоты в 5-летнем возрасте и образовали первые плоды на шестой год выращивания.

С целью ускорения выращивания сортового посадочного материала, повышения грунтовой всхожести семян рекомендуют замачивание их в водных растворах, содержащих соли различных элементов и другие активаторы ростовых процессов.

Из микроэлементов наиболее эффективным для предпосевной обработки семян всех видов древесных растений является марганец, для лиственницы и ели – медь, сосны – борная кислота и цинк. Высокая эффективность предпосевной обработки семян хвойных пород отмечена при использовании растворов, содержащих бор, медь, марганец, цинк при концентрации раствора от 0,002 до 0,005 %.

Во всех вариантах с обработкой семян микроэлементами сохранность сеянцев была выше контрольной. Однолетние сеянцы сосны и ели из семян, обработанных микроэлементами, по биометрическим показателям превышали контрольные на 25–60 %.

Различные микроэлементы оказывают неодинаковое воздействие на накопление массы в сухом состоянии у отдельных видов. Так, у сеянцев сосны под воздействием цинка увеличивается масса хвои, а под воздействием йода – корней.

Предпосевная подготовка семян на основе активаторов роста положительно сказывается и на сохранности сеянцев.

Корневое и некорневое применение стимуляторов роста улучшает ростовые процессы. Под воздействием стимуляторов роста улучшается качество посадочного материала и повышается выход саженцев с единицы площади. Так, обработка корневых систем сеянцев сосны перед посадкой в школьное отделение 0,01%-м раствором гетероауксина способствовала увеличению массы корней на 25–34 % по сравнению с контрольной. Обработка корней сеянцев сосны перед посадкой растворами микроэлементов, содержащих марганец и йод, была менее эффективной. В этих вариантах усиливался в основном рост надземной части и в меньшей степени корней, что приводило к диспропорции ассимилирующих и всасывающих органов.

50