Биохимия. Методические указания к практикуму по спецкурсу

Российский государственный университет им. И. Канта

Н.Е. Мороз

БИОХИМИЯ

Методические указания к практикуму по спецкурсу

Рекомендовано Редакционно-издательским советом РГУ им. И. Канта

Калининград Издательство Российского государственного университета им. И.

Канта

2005

ВВЕДЕНИЕ

Общие методические указания к лабораторным работам по специальному практикуму «Биохимия» предназначены для студентов старших курсов факультета биоэкологии РГУ им. И. Канта, обучающихся на специальности «Химия» и специализирующихся по биоорганической и медицинской химии. Методические указания составлены в соответствии с программой практикума, который проводится параллельно с лекционным курсом, поэтому в данном издании рассмотрены лишь те теоретические вопросы, которые необходимы для понимания эксперимента.

Целью спецкурса «Биохимия» является расширение представлений о некоторых классах биологически значимых соединений, а также ознакомление с важнейшими принципами и методами экспериментальной биохимии. Руководство должно облегчить студентам, приступающим к лабораторным работам, усвоение основных приемов практической биохимии, способствовать развитию у них навыков исследовательской работы, которые позволят впоследствии самостоятельно работать в биохимических лабораториях различного профиля.

Руководство включает методики выполнения лабораторных работ, иллюстрирующие некоторые методы выделения, очистки, физические и химические свойства, способы качественного и количественного определения аминокислот, белков, углеводов, липидов, ферментов и витаминов. Все работы многократно воспроизведены, что дает возможность сопоставить полученные результаты с теоретически ожидаемыми.

Для удобства в приложении представлены некоторые справочные данные, а также способы приготовления специальных реагентов.

4

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1

АМИНОКИСЛОТЫ

1. Качественные реакции на аминокислоты

Радикалы аминокислот исключительно разнообразны, что дает возможность использовать для обнаружения аминокислот цветные реакции, многие из которых весьма чувствительны и специфичны. Некоторые цветные реакции находят применение для количественного определения аминокислот. Качественные реакции на аминокислоты, а также биуретовая реакция лежат в основе методов качественного определения белков.

В данной работе в качестве исследуемого раствора использован разбавленный раствор яичного белка. Это позволит сделать вывод о наличии тех или иных аминокислот в составе яичного белка.

Приборы и оборудование:

1.Штатив с пробирками.

2.Спиртовка.

3.Держалка.

1.1. Нингидриновая реакция. Данная реакция основана на том,

что нингидрин взаимодействует с аминогруппами в -положении с образованием окрашенных продуктов. Сначала в результате взаимодействия аминокислоты с нингидрином образуется основание Шиффа, которое претерпевает перегруппировку, декарбоксилируется и расщепляется на альдегид и аминодикетогидринден:

5

Аминодикетогидринден конденсируется еще с одной молекулой нингидрина, в результате чего образуется окрашенное соединение, получившее название «сине-фиолетовый Руэмана»:

O O

N

OH O

сине-фиолетовый Руэмана

Ход работы. В пробирку наливают 0,5 мл раствора белка, добавляют 5 капель раствора нингидрина и нагревают. Появляется фиолетовое окрашивание.

1.2. Ксантопротеиновая реакция. Реакция основана на том, что ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин и триптофан) при нагревании с азотной кислотой дают желтоокрашенные нитросоединения. Последние при добавлении щелочи превращаются в соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет:

6

Ход работы. В пробирку наливают около 1 мл раствора белка, добавляют 0,5 мл концентрированной азотной кислоты и осторожно нагревают. Раствор окрашивается в желтый цвет.

1.3. Реакция Адамкевича на триптофан. Триптофан, взаимодей-

ствуя с глиоксиловой кислотой (примесь ледяной уксусной кислоты), дает красно-фиолетовое окрашивание:

Ход работы. В пробирку налить 0,5 мл раствора белка, добавить равный объем ледяной уксусной кислоты и нагреть, не доводя до кипения. Пробирку охладить и осторожно по стенке добавить 5—10 капель концентрированной серной кислоты. Слой серной кислоты опускается на дно. Через некоторое время, на границе жидкостей появляется красно-фиолетовое кольцо.

1.4. Реакция Паули на гистидин и тирозин. Реакция основана на том, что данные аминокислоты с диазореактивом в щелочной среде дают оранжево-красное окрашивание. В состав диазореактива входят сульфаниловая кислота, азотистокислый натрий и соляная кислота. При их взаимодействии происходит диазотирование сульфаниловой кислоты с образованием диазобензолсульфокислоты:

Диазобензолсульфокислота реагирует с гистидином (или тирозином), при этом получается азокраситель оранжево-красного цвета:

7

Ход работы. К 1 мл раствора сульфаниловой кислоты в 5%-ном растворе соляной кислоты приливают 1 мл раствора нитрита натрия, сильно встряхивают и немедленно добавляют сначала 1 мл раствора белка, а затем 3 мл 10%-ного раствора карбоната натрия. После смешивания растворов наблюдается красное окрашивание.

1.5. Нитропруссидная реакция на метионин и цистеин. При кипячении со щелочью аминокислоты, содержащие серу, разрушаются с образованием сернистого натрия. При взаимодействии последнего с нитропруссидом натрия образуется комплексная соль краснофиолетового цвета:

Na2S + Na2[Fe(CN)5NO] Na4[Fe(CN)5NOS].

Ход работы. В пробирку наливают 1 мл раствора белка, добавляют такое же количество 10%-ного раствора щелочи и 2—3 капли 5%-ного раствора нитропруссида натрия. Слегка нагревают. Если в белке есть указанные аминокислоты, то происходит реакция, в результате которой развивается красное или вишневое окрашивание.

1.6. Реакция Фоля на слабосвязанную серу. Реакция основана на том, что при разрушении щелочью содержащих серу аминокислот (цистин, цистеин) от белка отщепляется сероводород, который со свинцовыми солями дает черный осадок сернистого свинца:

8

Аминокислота метионин данной реакцией не открывается, так как более устойчива и при слабом щелочном гидролизе не разрушается.

Ход работы. В пробирку наливают 1 мл раствора уксуснокислого свинца и по каплям добавляют 10%-ный раствор гидроксида натрия до растворения образующегося осадка гидрата окиси свинца и образования плюмбита натрия. К полученному раствору прибавляют равное количество белка и смесь нагревают. Образуется черный осадок сульфида свинца.

1.7. Реакция Милона. Реактив Милона представляет собой смесь нитратов и нитритов оксидов ртути (I) и (II), растворенных в концентрированной азотной кислоте. Он дает окрашивание с фенолами и полифенолами. При взаимодействии его с фенольным ядром тирозина образуется нитрозимин, ртутное соединение которого окрашено в красный цвет:

Ход работы. В пробирку наливают 0,5 мл раствора белка и 4— 5 капель реактива Милона. В результате осаждения белка солями тяжелых металлов (ртути) образуется белый осадок. При слабом нагре-

вании (не выше 50 С) осадок окрашивается сначала в розовый, а затем в пурпурно-красный цвет.

1.8. Реакция Шульце-Распайля. Качественная реакция на аминокислоту триптофан. Триптофан, взаимодействуя с оксиметилфурфуролом, дает продукты конденсации, окрашенные в вишнево-красный цвет. Оксиметилфурфурол в данной реакции образуется из фруктозы под влиянием концентрированной серной кислоты:

9

Ход работы. К 0,5 мл раствора белка добавляют 0,5 мл 10%-ного раствора фруктозы и осторожно по стенке пробирки наслаивают около 1 мл концентрированной серной кислоты. Слегка встряхивают пробирку, и на границе двух слоев образуется вишнево-красное окрашивание.

Данный опыт можно также проводить, используя вместо раствора фруктозы раствор сахарозы. Окрашивание в данном случае будет несколько слабее.

1.9. Реакция Сакагучи. Качественная реакция на аминокислоту аргинин, содержащую гуанидиновую группировку. Производные гуа-

нидина, реагируя с гипобримитом натрия и -нафтолом, образуют продукты конденсации малиново-красного цвета:

Ход работы. К 1 мл раствора белка добавляют 4—5 капель 10%-ного раствора едкого натрия, 1—2 капли 0,1%-ного спиртового раствора -нафтола и хорошо перемешивают. Затем приливают несколько капель раствора гипобромита. Появляется малиново-красное окрашивание.

1.10. Биуретовая реакция. Данная реакция не является качественной на аминокислоты, а служит подтверждением наличия в молекуле белка пептидных связей. Основана на том, что пептидные группы белков образуют с медью комплексные соединения.

Окраска таких соединений зависит от количества атомов азота, принимающих участие в образовании комплекса, и варьируется от синей до красной, с преобладанием фиолетовой. Следует отметить, что для ди- и трипептидов биуретовая реакция ненадежна. Кроме того, биуретовая реакция положительна и с веществами небелкового характера, имеющими в своем составе не менее двух СО NH2 групп. К таким соединениям относятся оксамид H2N CO CO NH2, биурет H2N CO NH CO NH2 и некоторые другие.

10