Биохимия. Методические указания к практикуму по спецкурсу

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 8

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ

Впроцессе биологического окисления происходит перенос электронов и протонов с окисляемого вещества на восстанавливаемое. Частным случаем биологического окисления является тканевое дыхание — окисление органических веществ в тканях, сопровождающееся поглощением кислорода, образованием воды и биологических видов энергии. Окислительные процессы при тканевом дыхании протекают преимущественно путем дегидрирования, т. е. отнятия от окисляемого вещества электронов и протонов водорода. Акцептором водорода, отщепленного при дегидрировании от окисляемых веществ на последнем этапе тканевого дыхания, является кислород; при этом образуется конечный продукт окисления в тканях — вода. Дыхательная цепь — это последовательная цепь относящихся к классу оксидоредуктаз ферментов, осуществляющая перенос ионов водорода и электронов от окисляемых субстратов к молекулярному кислороду. В дыхательной цепи электрохимическая разность потенциалов преобразуется в синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата.

Вклетках эукариот дыхательная цепь расположена на поверхности или в глубине внутренней мембраны митохондрий. Порядок, в котором происходит передача протонов и электронов от одного посредника к другому, определяется соотношением их окислительновосстановительных потенциалов. Вещество с меньшим окислитель- но-восстановительным потенциалом способно передавать свои электроны (а часто и протоны) веществу с большим окислительновосстановительным потенциалом.

Оксидоредуктазы, участвующие в тканевом дыхании, представляют собой сложные белки.

1.Сопоставлениередокс-потенциалов рибофлавина

иметиленового синего

Вживых организмах наиболее важными донорами электронов служат атомы водорода органических молекул. При помощи перенос-

51

чиков электронов, имеющих промежуточный потенциал, осуществляется сложная последовательность реакций тканевого дыхания. Склонность к участию в окислительно-восстановительных реакциях может быть определена путем потенциометрических измерений, сводящихся к определению электродвижущей силы цепи, которая составлена из химически инертного электрода, погруженного в исследуемую редокс-систему, и электрода сравнения (водородного или каломельного)

Стандартные окислительно-восстановительные потенциалы, измеренные при рН 7, обозначаются Е'о. Окислительно-восстановитель- ный потенциал является величиной пропорциональной изменению свободной энергии. Вещество с большим окислительно-восстанови- тельным потенциалом (с учетом алгебраического знака) окисляет вещество с меньшим окислительно-восстановительным потенциалом. Таким образом, редокс-потенциалы являются мерой способности молекул обмениваться электронами.

Помимо потенциометрического измерения часто используют колориметрический метод, наблюдая изменение окраски специальных редокс-индикаторов в испытуемом растворе. Обычно в восстановленном состоянии эти индикаторы бесцветны, а в окисленном обладают определенной окраской. Причем для каждого индикатора зона перехода связана с характерной для него величиной Е'о. Например, для метиленового синего (±2 е) Е'о составляет +0,011 в, для водород-

ного электрода (Н2 2Н+ + 2 е) — –0,420 в, для НАД+ (±2 е) — –0,320 в, для рибофлавина (±2 е) — –0,208 в, для цитохрома с (± е)

— +0,260 в, для цитохрома а (± е) — +0,290 в, для кислородного

электрода (½О2 + 2Н+ + 2е Н2О) — +0,810 в. Сравнивая стандартные редокс-потенциалы этих систем, можно заключить, что метиленовый синий пригоден для выявления восстановленных форм никотинамидных и флавиновых оксидоредуктаз. Обесцвечивание метиленового синего при восстановлении послужило основой для определения дегидрогеназ.

Приборы и оборудование:

1.Штатив с пробирками.

2.Рибофлавин, 0,025%-ная суспензия.

Ход работы. В пробирку наливают 5—6 капель воды, 1 каплю взвеси рибофлавина и добавляют по каплям раствор метиленового

52

синего до появления синего или зеленовато-синего окрашивания смеси.

Бросают в окрашенную смесь кусочек цинка и капают 1 каплю концентрированной соляной кислоты. Выделяющийся водород начинает снижать редокс-потенциал системы, происходит восстановление метиленового синего и рибофлавина. Восстановление первого происходит быстрее, поэтому цвет смеси становится вначале зеленым, затем зеленовато-желтым и, наконец, бледно-желтым или розоватым.

Слабоокрашенную жидкость сливают в другую пробирку и наблюдают за изменением цвета. Водород более не образуется, а остаток его уходит в воздух. Восстановленная форма рибофлавина через метиленовый синий передает электроны и ионы водорода на кислород воздуха, и раствор желтеет. После этого происходит окисление лейкометиленового синего, и содержимое пробирки меняет цвет через зеленый в синий.

Записать результаты опыта и составить схему переноса водорода (электронов и ионов водорода) с учетом стандартных окислительновосстановительных потенциалов использованных компонентов.

2. Обнаружение дегидрогеназ в молоке (реакция Шардингера)

Действие дегидрогеназ можно исследовать на примере дегидрогеназы молока (ксантиноксидаза или альдегиддегидрогеназа, КФ 1.1.3.22). Фермент способен окислять формальдегид и другие альдегиды алифатического и ароматического ряда. По химической природе он представляет собой флавопротеин, содержащий молибден и железо. Дегидрогеназа, находящаяся в молоке, относительно термостабильна и хорошо проявляет свое действие при температуре 70 °С. Дегидрирующее действие фермента можно наблюдать, если к свежему молоку в качестве субстрата добавить формальдегид, а в качестве акцептора водорода — метиленовую синь, и изолировать смесь от доступа кислорода. Спустя некоторое время синее окрашивание исчезает. Процесс обесцвечивания метиленовой сини является результатом каталитического влияния дегидрогеназы, переносящей электроны и протоны от субстрата на краситель, восстанавливая его в бесцветное лейкопроизводное.

53

Ход работы. В две пробирки наливают по 1 мл свежего сырого молока. Молоко во второй пробирке кипятят и затем охлаждают. В обе пробирки добавляют по 2 капли 0,4%-ного раствора формальдегида, по 1 капле 0,02%-ного раствора метиленовой сини и взбалтывают. Жидкость в обеих пробирках покрывают слоем вазелинового масла (по 5 капель) и помещают в водяную баню или термостат при 70 С. Через некоторое время наблюдают обесцвечивание жидкости в первой пробирке. Содержимое второй пробирки не обесцвечивается, так как фермент был инактивирован кипячением.

Эту реакцию можно использовать для отличия сырого молока от кипяченого.

54

СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Основная

Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия. М.: Дрофа, 2004.

Сорвачев К.Ф. Биологическая химия. М.: Просвещение, 1971. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3 т. М.: Мир, 1985.

Березин И.С., Савин Ю.В. Основы биохимии. М.: Изд-во МГУ, 1990. Практикум по биологической химии / Под ред. В.И. Добрыниной. М.:

Высш. шк., 1986.

Дополнительная

Биохимия / Под ред. В.В. Меньшикова. М.: ФиС, 1986.

Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990.

55

56

57

Таблица 3

Формула сбалансированного питания

Окончание табл. 3

Энергетическая ценность — 2 850 ккал (11 900 кДж)

59

60