Биохимия. Методические указания к практикуму по спецкурсу

аналитических весах, предварительно высушив до постоянной массы. После взвешивания пакетик помещают в экстрактор аппарата Сокслета. В один экстрактор можно поместить до 4—5 пакетиков с различными материалами. Экстрактор может быть наполовину наполнен растворителем. Затем все части аппарата Сокслета герметически соединяют, включают холодильник и через холодильник доливают столько растворителя, чтобы он свободно стекал из экстрактора в колбу. Нагрев ведут на водяной бане, соблюдая осторожность при работе с эфиром.

По окончании экстракции обезжиренные пакетики вынимают из аппарата Сокслета и высушивают сначала на стекле в вытяжном шкафу, а после удаления эфира — в сушильном шкафу при 100— 150 ºС до постоянной массы. Затем пакетики взвешиваются на аналитических весах и определяют содержание липидов. Содержание липидов выражают в процентах на абсолютно сухое вещество.

3. Определение констант жира

При биологических и технических исследованиях часто встречается необходимость определить состав жира или его качество. Для решения этих вопросов выработан ряд показателей, которые характеризуют состояние или состав жира и называются константами жира. К таким константам относятся температура плавления, кислотность, число омыления, йодное число и т. д.

3.1. Определение кислотности жира. Кислотностью (или кис-

лотным числом) жира называют количество мг гидроксида калия, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира. Свободные жирные кислоты получаются в результате гидролиза жира или под действием ферментов и микробов при неправильном хранении жира.

Приборы и оборудование:

1.Два стаканчика на 150 мл.

2.Бюретка на 50 мл.

Ход работы. Отвесить на аналитических весах 2—3 г жира с точностью до 0,01 г. Прибавить к жиру смесь эфира со спиртом (1 : 1) до

31

растворения жира. После этого добавить 1 мл раствора фенолфталеина и титровать 0,1 н. раствором КОН до появления слабо-розовой окраски, не исчезающей в течение минуты. На основе результатов титрования рассчитать кислотность исследованного жира.

где VКОН — объем раствора щелочи, пошедший на титрование, мл;

А— навеска жира, г;

К— коэффициент поправки для щелочи;

СКОН — концентрация раствора щелочи (0,1 н.); МКОН — молярная масса КОН (56 г/моль).

3.2. Определение йодного числа. Йодным числом называют количество граммов йода, способное присоединиться к 100 г жира. Йодное число позволяет судить о степени ненасыщенности жирных кислот, входящих в состав жира. Принцип определения йодного числа заключается в том, что навеску исследуемого жира обрабатывают определенным количеством спиртового раствора йода, взятого в избытке, а затем избыток йода оттитровывают.

Приборы и оборудование:

1.Две конические колбы на 150 мл и две — на 500 мл.

2.Бюретка на 50 мл.

Ход работы. Отвесить на аналитических весах 0,1—0,2 г жира с точностью до 0,01 г и поместить в колбу. Добавить 10 мл этилового спирта до полного растворения жира. Если жир будет плохо растворяться, можно добавить еще 15 мл спирта (итого 25 мл). Для контрольного опыта во вторую колбу помещают 10 мл (или 25 мл) этилового спирта. В каждую колбу (опытную и контрольную) приливают по 25 мл 0,2 н. спиртового раствора йода из бюретки. Содержимое перемешивают и приливают по 200 мл дистиллированной воды. Еще раз хорошо встряхивают и, закрыв пробкой, выдерживают 5 минут. После этого оттитровывают избыток йода 0,1 н. раствором тиосульфата, сначала до появления светло-желтого окрашивания, а потом, после прибавления 1 мл раствора крахмала, — до исчезновения синего окрашивания.

32

Разность между количеством тиосульфата, затраченного на титрование опыта и контроля, является показателем количества йода, связанного навеской масла. Йодное число (в г) вычисляют по формуле

(V1 V2 ) К 0,0127 100 ,

A

где V1 — количество 0,1 н. раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование контроля, мл;

V2 — количество 0,1 н. раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование опыта, мл;

А — навеска жира, г; К — коэффициент поправки для раствора тиосульфата;

0,0127 — количество йода, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора тиосульфата.

33

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6

УГЛЕВОДЫ

Углеводы — наиболее распространенные в природе органические вещества. В организме человека они являются не только источником энергии, но и важным пластическим материалом. Углеводы и их производные входят в состав многочисленных биологически активных соединений.

Различают углеводы простые (моносахариды) и сложные (олигосахариды и полисахариды).

Моносахариды представляют собой альдегидоили кетоспирты, существующие как в открытой карбонильной форме, так и в циклических формах. Моносахариды обладают свойствами как спиртов, так и карбонильных соединений. При восстановлении карбонильной группы образуются многоатомные спирты. При окислении в первую очередь окисляется карбонильная группа, а затем возможно окисление спиртовых гидроксилов. На способности моносахаридов восстанавливать различные соединения основаны методы качественного и количественного определения моносахаридов.

Молекулы сложных углеводов состоят из нескольких остатков моносахаридов, соединенных между собой эфирными связями. По типу связи дисахариды можно разделить на две группы — восстанавливающие и невосстанавливающие. При гидролизе сложные углеводы распадаются на составляющие их моносахариды.

1. Качественные реакции на углеводы

Приборы и оборудование:

1.Штатив с пробирками.

2.Спиртовка.

3.Держалка.

1.1. Реакция Троммера. Моносахариды обладают способностью восстанавливать в щелочной среде ионы меди, висмута, серебра и др.

34

Реакция эта обусловлена наличием в молекуле моносахаридов альдегидной группы, которая чрезвычайно легко окисляется, превращаясь в карбоксильную группу. Кетозы также дают реакции восстановления металлов. Это объясняется тем, что в щелочной среде кетозы могут переходить в эпимерные альдозы, которые и проявляют восстанавливающие свойства.

Ход работы. В пробирку наливают 1 мл раствора глюкозы и 1 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия. К смеси прибавляют при встряхивании по каплям 5%-ный раствор сульфата меди до появления неисчезающей мути гидроксида меди (II). Осторожно нагревают верхнюю часть содержимого пробирки. Появляется желтое окрашивание, характерное для гидроксида меди (I), которое со временем переходит в красное окрашивание, характерное для оксида меди (I).

1.2. Реакция Фелинга. Реакцию Троммера нельзя проводить в присутствии избытка солей меди, так как желтая или красная окраска маскируется черным осадком окиси меди (II), образующимся при нагревании гидроксида меди в щелочной среде. Для устранения этого недостатка было предложено проводить реакцию Троммера с реактивом Фелинга, преимущество которого заключается в том, что избыток гидроксида меди связывается входящей в реактив сегнетовой солью. Реактив Фелинга представляет собой два раствора: «Фелинг-1» (раствор сернокислой меди в воде) и «Фелинг-2» (раствор гидроксида натрия и сегнетовой соли в воде). Перед работой растворы можно смешать в соотношении 1 : 1.

35

Ход работы. В пробирку наливают 1 мл раствора глюкозы и добавляют равный объем реактива Фелинга. Смесь нагревают на спиртовке до кипения. Образовавшийся красный осадок оксида меди (I) свидетельствует о положительной реакции на реактив Фелинга.

Проделать реакцию Фелинга с мальтозой, сахарозой, крахмалом. Результаты объяснить.

1.3. Реакция Барфеда. (Отличие восстанавливающих дисахаридов от моносахаридов). Данная реакция отличается от предыдущих тем, что окисление сахара протекает не в щелочной среде, а в среде, близкой к нейтральной. В этой среде восстанавливающие дисахариды практически не окисляются, что позволяет отличить их от моносахаридов.

Ход работы. В две пробирки налить по 3 мл реактива Барфеда. В первую добавить 1 мл раствора глюкозы, во вторую — 1 мл раствора мальтозы. Осторожно нагреть пробирки на водяной бане в течение 10 минут. Моносахариды восстанавливают реактив до оксида меди (I), дисахариды реакции не дают. При нагревании следует избегать кипячения, так как дисахариды в кислой среде могут гидролизоваться.

36

1.4. Реакция Селиванова. Кетогексозы при нагревании с соляной кислотой дают оксиметилфурфурол, который с резорцином образует соединение, окрашенное в вишнево-красный цвет. Альдозы также дают эту реакцию, но протекает она медленнее и в особых условиях (длительное нагревание, кислотность).

Ход работы. В две пробирки наливают по 2 мл реактива Селиванова. В первую добавляют 0,5 мл фруктозы, во вторую — 0,5 мл глюкозы. Обе пробирки помещают в водяную баню (горячую, но не кипящую) и держат 5 минут. За это время в пробирке с фруктозой появляется вишнево-красное окрашивание.

1.5.Реакция крахмала с иодом. Реакция с йодом является качественной на крахмал. В результате образования йодкрахмального комплекса появляется характерное сине-фиолетовое окрашивание.

Ход работы. В пробирку наливают 1 мл раствора крахмала и добавляют 1—2 капли йода (или раствора Люголя, представляющего собой раствор йода в йодистом калии). Появляется сине-фиолетовое окрашивание. Пробирку нагревают, окраска при этом исчезает, но вновь появляется при охлаждении. Объясняют результаты опыта.

1.6.Гидролиз сахарозы. Сахароза является дисахаридом, который

вкислой среде гидролизуется с образованием составляющих его моносахаридов.

37

Ход работы. В пробирку наливают 2 мл раствора сахарозы и добавляют 0,5 мл 10%-ного раствора серной кислоты. Полученный раствор кипятят в течение 5 минут, затем охлаждают. Нейтрализуют сухим гидрокарбонатом натрия. После нейтрализации полученный раствор делят на две части. С одной проводят реакцию Фелинга, с другой

—реакцию Селиванова.

1.7.Реакция Молиша с -нафтолом. Для открытия углеводов в биологическом материале иногда пользуются их способностью образовывать с концентрированной серной кислотой фурфурол (или замещенный фурфурол), дающий красно-фиолетовое окрашивание с

-нафтолом.

Ход работы. К 1 мл раствора углевода добавляют 2 капли спирто-

вого раствора -нафтола и по стенке пробирки осторожно, без встряхивания, 1 мл концентрированной серной кислоты. Серная кислота опускается на дно пробирки и на границе двух жидкостей образуется красно-фиолетовое кольцо.

1.8. Реакция с фенилгидразином (образование озазонов). Моно-

сахариды и восстанавливающие дисахариды могут реагировать с фенилгидразином с образованием продуктов конденсации (озазонов), которые представляют собой кристаллические вещества, легко различимые под микроскопом.

38

Чувствительность реакции велика, поэтому её применяют для выявления углеводов, находящихся в биологическом материале в небольших количествах.

Озазоны различных сахаров почти нерастворимы в воде, имеют неодинаковую форму кристаллов (рис. 2) и различную температуру плавления. Поэтому данная реакция используется также для распознавания (и разделения) различных сахаров в тех случаях, когда они совместно присутствуют в растворах.

Рис 2. Кристаллы различных озазонов:

а— озазоныглюкозы(кристаллизуютсяввидетонкихжелтыхиголок, собранных

впучки или кисточки); б — озазоны мальтозы (имеют форму соединенных между собой ланцетовидных пластинок); в— озазоны лактозы (кристаллизуются

ввиде тонких игл, собранных в шарообразные пучки)

Ход работы. Насыпают столько смеси солянокислого фенилгидразина с уксуснокислым натрием (2:3), чтобы заполнить закругленную часть пробирки, прибавляют 20—30 капель 1%-ного раствора глюкозы, взбалтывают и оставляют в кипящей водяной бане на 30—45 минут. Содержимое пробирки время от времени перемешивают путем встряхивания. По истечении указанного срока дают жидкости медленно охладиться. Выделившийся осадок озазона глюкозы в виде желтых кристаллов исследуют под микроскопом. Форму кристаллов зарисовывают.

2. Определение альдоз (сахаров) методом Бертрана

Метод Бертрана основан на способности альдоз восстанавливать окисные соединения меди (II) до соединений меди (I):

39

Медь применяется в виде фелинговой жидкости, в которой гидроксид меди (II) существует в виде комплексного соединения синего цвета. Образовавшийся в результате реакции оксид меди (I) окисляется соединениями трехвалентного железа — сернокислым железом или железоаммиачными квасцами. Количество восстановленного при этом железа (II) определяется титрованием перманганатом калия.

Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 = 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O 10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 = 5Fe2(SO4)3 + K2SO4 + 2MnSO4 + H2O

Поскольку в данной реакции валентность меди и железа меняется на единицу, следовательно, грамм-эквивалент меди соответствует ее атомному весу, а 1 л децинормального раствора соответствует 6,36 г меди (соответственно 1 мл — 6,36 мг меди). По количеству пошедшего на титрование перманганата калия можно вычислить количество восстановленной меди. Для определения количества альдозы (сахара) по количеству восстановленной меди пользуются специальными таблицами, составленными на основании опытов для различных сахаров.

Приборы и оборудование:

1.Коническая колба на 200 мл.

2.Плитка.

3.Прибор для фильтрования под вакуумом.

4.Бюретка.

5.Цилиндры, стеклянная палочка.

Ход работы. В коническую колбу на 200 мл отмерить 20 мл исследуемого раствора, прилить цилиндром по 20 мл каждого из двух растворов Фелинга. Все перемешать, быстро нагреть до кипения и слабо кипятить ровно 3 минуты. Моментом начала кипения считать появление первых пузырьков. Колбочку снять с огня, дать осесть оксиду меди (I) и жидкость слить по палочке в воронку стеклянного фильтра, стараясь не переносить по возможности на фильтр осадка. При слабом разряжении жидкость отфильтровать. Она должна иметь чисто синюю окраску. Оставшийся в колбе оксид меди (I) промывать дистиллированной водой до тех пор, пока промывная вода не перестанет давать щелочную реакцию на лакмус. При этом воды в колбу

40