Биохимия. Методические указания к практикуму по спецкурсу

следует наливать столько, чтобы она могла свободно поместиться на воронке фильтра, а сливая ее, также стараться не переносить осадка на фильтр. Промывание и отсасывание вести таким образом, чтобы над осадком постоянно был слой жидкости, так как на воздухе закись меди окисляется. После промывания колбу Бунзена отсоединить от насоса, вылить содержимое, в несколько приемов ополоснуть дистиллированной водой, опять вставить в нее фильтр и присоединить к насосу.

В колбу Эрленмейера с оставшимся в ней осадком закиси меди налить 10 мл раствора сернокислого железа (способ приготовления см. в приложении 2) и растворить в нем осадок. Этим же раствором ополоснуть и стенки колбы, а затем вылить его на фильтр. Колбу еще раз промыть 10 мл раствора сернокислого железа. Дать раствориться осадку на фильтре, для чего фильтр потереть стеклянной палочкой. Затем включить насос и отфильтровать жидкость, колбу и фильтр несколько раз промыть холодной дистиллированной водой до исчезновения кислой реакции на лакмус в промывной воде (пробовать в воронке фильтра). Собранную в колбу Бунзена жидкость оттитровать раствором KMnO4 до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 1—2 минут. Вычислить количество восстановленной меди по формуле

X = 6,36 А,

где А — количество раствора KMnO4, мл.

По таблице 2 приложения 1 определить количество альдозы.

41

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 7

ВИТАМИНЫ

Витаминами называются органические вещества, необходимые организму для нормальной жизнедеятельности. Витамины практически не вырабатываются организмом и должны поступать вместе с пищей. Различные витамины играют различную роль в организме.

Вместе с исследованием пищевого значения и строения витаминов особую актуальность имеют качественные и количественные методы определения витаминов в различных биологических материалах.

1. Качественные методы определения витаминов

Приборы и оборудование:

1.Штатив с пробирками.

2.Спиртовка.

3.Держалка.

1. Витамин D.

Витамин D можно определять в аптечном препарате или в рыбьем жире.

1.1. Реакция с анилином. В сухую пробирку наливают 1 мл исследуемого раствора и добавляют 1 мл смеси анилина с концентрированной соляной кислотой (15:1), перемешивают, осторожно нагревают. При наличии витамина D желтая эмульсия становится сначала зеле-

42

ной, а затем красной. Через 1—2 минуты эмульсия делится на два слоя, из которых нижний окрашен в интенсивный красный цвет.

1.2. Бромхлороформная проба. В сухую пробирку наливают 1 мл исследуемого раствора и 1 мл раствора брома в хлороформе. В присутствии витамина D возникает зеленовато-голубое окрашивание.

2. Витамин В1 (тиаминхлорид).

2.1.Взаимодействие витамина В1 с диазореактивом. К 5 каплям

5%-ного раствора сульфаниловой кислоты прибавляют 5 капель 5%-ного раствора нитрита натрия. К полученному раствору диазоре-

актива добавляют небольшое количество витамина В1 и 5—7 капель 10%-ного раствора карбоната натрия. Жидкость окрашивается в оранжево-красный цвет.

2.2.Реакция окисления тиамина в тиохром. Витамин В1 при нагревании с гексациано(III)ферратом калия окисляется до тиохрома, имеющего желтую окраску.

Ход работы. В две пробирки наливают по 5—10 капель 10%-ного раствора КОН (NаОН) и столько же 5%-ного раствора К3[Fe(CN)6].

Впервую пробирку добавляют около 1 мл витамина В1, а во вторую

— 1 мл воды. Обе пробирки нагревают. В первой пробирке жидкость окрашивается в оранжево-желтый цвет, вторая пробирка служит контролем.

3. ВИТАМИН В2 (рибофлавин).

Реакция восстановления витамина В2. Реакция основана на спо-

собности рибофлавина легко восстанавливаться и вновь окисляться. При восстановлении водород присоединяется к азоту по месту двойных связей в изаллоксазиновом кольце. Выделяющийся при взаимодействии цинка с соляной кислотой водород восстанавливает рибо-

43

флавин (раствор желтого цвета) через розовый (или красный) родофлавин в бесцветное соединение — лейкофлавин:

Ход работы. Наливают в пробирку 0,5 мл 0,1%-ного раствора рибофлавина, добавляют 5 капель концентрированной соляной кислоты и небольшой кусочек металлического цинка. Наблюдают интенсивное выделение пузырьков водорода. Жидкость постепенно окрашивается в розовый или красный цвет, а затем окраска бледнеет и происходит полное обесцвечивание раствора.

При взбалтывании обесцвеченного раствора с воздухом лейкосоединение вновь окисляется в рибофлавин.

Поскольку витамин В2 участвует в построении флавиновых ферментов, описанная реакция имитирует действие этих ферментов в процессе тканевого дыхания.

4. Витамин С (аскорбиновая кислота).

4.1. Реакция с гексациано(III)ферратом калия. Аскорбиновая кис-

лота, окисляясь, восстанавливает гексациано(III)феррат калия K3[Fe(CN)6] до гексациано(II)феррата калия K4[Fe(CN)6], который с ионом железа (III) образует в кислой среде гексациано(II)феррат железа Fe4[Fe(CN)6]3 (берлинскую лазурь).

44

3 K4Fe(CN)6 + 4 FeCl3 Fe4[Fe(CN)6]3 + 12 KCl

берлинская лазурь

Ход работы. К 1 мл 1%-ного раствора витамина С прибавляют 2— 3 капли раствора гидроксида калия, 2—3 капли раствора гексациано(III)феррата калия и энергично встряхивают. Затем добавляют в пробирку 5—10 капель 10%-ного раствора соляной кислоты и 2— 3 капли раствора хлорида железа (III). Выпадает синий (или зеленова- то-синий) осадок берлинской лазури.

4.2. Качественная реакция на аскорбиновую кислоту с раствором йода. Основана на способности аскорбиновой кислоты окисляться в дегидроаскорбиновую. Молекулярный йод при этом восстанавливается с образованием йодисто-водородной кислоты.

Ход работы. В пробирку наливают 1 мл дистиллированной воды и добавляют 1—2 капли 0,1%-ного раствора йода. Добавляют 0,5 мл 1%-ного раствора аскорбиновой кислоты. Встряхивают и наблюдают обесцвечивание раствора йода.

5. Витамин А (ретинол).

CH3

Витамин А можно определять в аптечном препарате или в рыбьем жире.

45

5.1.Реакция с треххлористой сурьмой. Данная реакция получает-

ся только при отсутствии любых следов воды в реактивах и посуде, в противном случае из треххлористой сурьмы образуется хлорокись сурьмы, которая не реагирует с витамином А. В целях связывания воды рекомендуется добавлять к исследуемому веществу несколько капель уксусного ангидрида. Реакция не является специфичной, так как аналогичное окрашивание дают все соединения с сопряженными двойными связями.

Ход работы. В сухую пробирку вносят 3—4 капли исследуемого вещества и добавляют 0,5 мл насыщенного раствора треххлористой сурьмы в хлороформе. Наблюдают появление синего окрашивания, постепенно переходящего в розово-фиолетовое.

5.2.Реакция с серной кислотой (реакция Друммонда). В основе данной реакции лежит способность серной кислоты отнимать от витамина А воду с образованием цветных продуктов реакции.

Ход работы. В сухой пробирке растворяют несколько капель исследуемого вещества в 5—6 каплях хлороформа. Добавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты. Появляется голубое окрашивание, быстро переходящее в буро-красное.

2. Количественное определение витамина С

Количественные методы определения аскорбиновой кислоты основаны на её способности легко окисляться в дегидроаскорбиновую кислоту. В качестве окислителя при титровании аскорбиновой кислоты применяется синяя краска 2,6-дихлорфенолиндофенол, которая в щелочной среде имеет синюю окраску, в кислой — красную, а при восстановлении переходит в бесцветную лейкоформу.

Перед определением витамин С экстрагируют разбавленной кислотой.

Приборы и оборудование:

1.Ступка с пестиком.

2.Мерная колба на 50 мл.

3.Воронка аналитическая, фильтры.

4.Пипетки.

5.Бюретка на 50 мл.

Ход работы. На технических весах отвесить около 5 г исследуемого материала, поместить в ступку, облить 15—20 мл 2%-ного раствора соляной кислоты и по возможности быстро растереть (грубый материал лучше растирать с кварцевым песком или с битым стеклом). Полученную смесь перенести с помощью стеклянной палочки в мерную колбу на 50 мл. Ступку и пестик обмыть 2%-ной соляной кислотой, которую вылить в ту же колбу. Объем колбы довести до метки 2%-ной соляной кислотой. Жидкость из колбы отфильтровать в сухую посуду, из фильтрата взять пипеткой 10 мл в колбу для титрования и оттитровать 0,001 н. раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления не исчезающего в течение 30 секунд розового окрашивания. Количество аскорбиновой кислоты рассчитать по формуле

X n K V 0,088 100 ,

A V1

где Х — содержание аскорбиновой кислоты, мг% (количество мг в 100 г продукта);

n — количество 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедшее на титрование, мл;

К — поправка к титру 2,6-дихлорфенолиндофенола; V — объем приготовленной вытяжки (50 мл);

V1 — аликвотная часть (10 мл);

А — навеска исследуемого вещества, г; 0,088 — количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл 0,001 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, мг;

100 — коэффициент для пересчета на 100 г продукта.

47

3. Количественное определение витамина А

Метод основан на реакции витамина А с треххлористой сурьмой в присутствии уксусного ангидрида, в результате которой смесь окрашивается в синий цвет. Интенсивность окраски, пропорциональную количеству витамина в пробе, определяют с помощью фотоэлектрокалориметра.

Приборы и оборудование:

1.ФЭК с кюветами рабочей длины 10 мм.

2.Колбочки мерные на 25 и 100 мл.

3.Пипетка.

4.Стеклянные стаканчики.

Ход работы. Растворить 1—2 г исследуемого вещества в хлороформе в мерной колбе на 25 мл. В одну из кювет ФЭКа помещают 0,4 мл хлороформного раствора, прибавляют 1—2 капли уксусного ангидрида для предупреждения появления мути и 4 мл раствора треххлористой сурьмы. Через 10 секунд пробу фотометрируют с красным светофильтром против контроля. Контроль готовят так же, как и опытную пробу, но вместо хлороформного раствора исследуемого вещества отмеривают 0,4 мл чистого хлороформа. Содержание витамина А в исследуемом веществе находят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Построение производится с помощью стандартизированного высокоактивного аптечного препарата витамина А (ретинола ацетата) в масле. Если содержание витамина А в 1 мл аптечного препарата равно 100 000 МЕ, то для приготовления основного стандартного раствора берут 0,1 мл этого препарата и растворяют в хлороформе в мерной колбе на 100 мл. Таким образом, в 1 мл полученного раствора содержится 100 МЕ витамина А.

Из основного стандартного раствора готовят 5 разведений с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора содержалось 20, 40, 60, 80, 100 МЕ витамина.

Далее 0,4 мл приготовленных растворов обрабатывают треххлористой сурьмой и определяют их оптическую плотность. На основе полученных данных строят калибровочный график, где на оси ординат наносят найденное значение оптической плотности, а на оси абсцисс

— содержание витамина А в МЕ/мл.

48

Вычисляют содержание витамина А в 1 г исследуемого вещества в МЕ по формуле

X CAV ,

где С — содержание витамина А в 1 мл исследуемого раствора, МЕ (находят по калибровочному графику);

V — общий объем хлороформного раствора, в котором растворена навеска исследуемого вещества, мл;

А — навеска исследуемого вещества, г.

Одной интернациональной единице (1 МЕ) соответствуют 0,344 мкг ацетата витамина А или 0,6 мкг -каротина.

4. Хроматографическое определение каротина

Принцип определения -каротина заключается в очистке -каро- тинового экстракта путем колоночной хроматографии через оксид алюминия.

Приборы и оборудование:

1.Ступка фарфоровая.

2.Стеклянная хроматографическая колонка размером 20 300 мм, на дно которой положена вата, плотно наполненная оксидом алюминия так, чтобы высота сорбента была 170 мм. Поверх оксида алюминия наносится слой безводного сульфата натрия в 1 см.

3.Мерные цилиндры.

4.Воронка аналитическая, фильтры.

Ход работы. Исследуемое вещество (например, сухую морковь, сухие листья крапивы) в количестве 1 г экстрагируют 30 мл смеси ацетона с гексаном (3 : 7) в течение 5—10 минут в ступке при растирании. Экстракт отфильтровывают в мерный цилиндр и разбавляют гексаном так, чтобы раствор содержал 9 % ацетона. Весь экстракт наносят на колонку и элюируют 100 мл смеси ацетона с гексаном

(1 : 9).

В то время как хлорофилл и ксантофиллы желтого цвета (в случае их присутствия) задерживаются в верхней части колонки, фракции

49

каротиноидов быстро элюируются в следующем порядке: -каротин,-каротин, -каротин.

50