Биохимия. Методические указания к практикуму по спецкурсу

Можно рассчитать количество азота аминогрупп в миллиграммах в исследуемом растворе. Атомная масса азота равна 14. Таким образом, 1 н. раствору щелочи соответствуют 14 г азота в 1 л или 14 мг в 1 мл (1 аминогруппа на 1 эквивалент щелочи). Отсюда следует, что 1 мл 0,005 н. раствора щелочи соответствуют 0,07 мг азота.

Приборы и оборудование:

1.Круглодонная колба на 100 мл.

2.Обратный холодильник (шариковый).

3.Пипетки.

4.Микробюретка.

5.Конические колбы на 50 мл.

Ход работы. Проделывают биуретовую реакцию с раствором белка до гидролиза.

Определяют в белке карбоксильные группы методом формольного титрования. Для титрования карбоксильных групп отбирают в колбочку 1 мл раствора белка, добавляют 5 капель 20%-ного нейтрального раствора формалина и 3 капли раствора фенолфталеина. Титруют до устойчивой розовой окраски 0,005 н. раствором гидроксида натрия из микробюретки. Отмечают количество затраченной щелочи и производят вычисление содержания азота аминогрупп.

Для гидролиза отбирают в круглодонную колбу 20 мл раствора яичного белка и 5 мл концентрированной соляной кислоты удельного веса 1,18. Колбочку закрывают пробкой с водяным обратным холодильником. Смесь кипятят под тягой в течение часа.

Через 1 час гидролиз прерывают. Пробку с холодильником удаляют. Для обесцвечивания буроватого гидролизата в колбочку всыпают на кончике ножа активированный уголь и кипятят 5 минут.

После кипячения жидкость охлаждают и берут несколько ее капель для биуретовой реакции, предварительно нейтрализовав щелочью.

Содержимое колбы выливают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой и фильтруют.

Для титрования карбоксильных групп после гидролиза берут 1,25 мл прозрачного, бесцветного гидролизата (что соответствует 1 мл раствора белка). Добавляют 3 капли фенолфталеина и нейтрализуют 10%-ным раствором гидроксида натрия из бюретки до слаборозовой окраски (при этом количество щелочи не учитывается).

21

В случае, когда при нейтрализации окраска делается ярко-красной, добавляют до обесцвечивания по каплям 1%-ный раствор соляной кислоты. Избыток соляной кислоты нейтрализуют 0,005 н. раствором гидроксида натрия, добавляя его по каплям до слабо-розового окрашивания (при этом количество щелочи не отмечается).

После этого добавляют 5 капель нейтрального раствора формалина и встряхивают колбу. Свободные карбоксильные группы оттитровывают 0,005 н. раствором гидроксида натрия из микробюретки до розовой окраски. Количество затраченной на титрование щелочи точно измеряют и учитывают при расчете азота аминогрупп.

Результаты биуретовой реакции и титрования карбоксильных групп в растворе белка до и после гидролиза заносятся в таблицу.

22

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4

ФЕРМЕНТЫ

Ферменты — специфические белки, которые играют роль биологических катализаторов. Они входят в состав всех клеток и тканей живых организмов. Благодаря ферментам химические реакции в живом организме протекают с большой скоростью при обычной температуре тела и без участия сильнодействующих химических реагентов. Вещество, превращение которого катализируется в ходе ферментативной реакции, носит название субстрата.

Для ферментов характерны следующие свойства: специфичность действия, термолабильность, чувствительность к изменению реакции среды, изменение активности фермента под действием активаторов или ингибиторов.

Свойства ферментов в данной работе изучаются на примере амилазы слюны, субстратом амилазы являются полисахариды крахмал и гликоген. -Амилаза ( -1,4-глюкан-4-глюканогидролаза; КФ 3.2.1.1) слюны относится к классу гидролаз. -Амилаза гидролизует

-1,4-глюкановые связи в крахмале, гликогене и олигосахаридах, которые разрываются без определенного порядка. О ходе гидролиза крахмала можно судить по изменению окраски, возникающей при добавлении раствора йода в инкубационную среду. Крахмал дает с йодом синее окрашивание, декстрины в зависимости от длины цепочки

— фиолетовое или красновато-коричневое. В пробирке, где гидролиз прошел полностью, цвет инкубационной среды сохраняет слабо-жел- тую окраску раствора йода.

В качестве конечного продукта гидролиза под действием

-амилазы образуется смесь дисахарида мальтозы и моносахарида глюкозы. И мальтоза, и глюкоза имеют свободные альдегидные группы, вследствие чего они обладают восстановительной способностью и открываются пробой Троммера.

23

Гидролиз крахмала можно представить следующей схемой:

Приборы и оборудование:

1.Два стаканчика на 150 мл и 1 стакан на 400—500 мл.

2.Аналитическая воронка средняя с фильтрами.

3.Три пробирки со шкалой.

4.Штатив с маленькими пробирками.

5.Термометр до 100 С.

6.Пипетки для отбора проб.

7.Промывалка с дистиллированной водой.

8.Лед.

Ход работы.

1. Приготовление разведенной слюны.

Прополоскать рот два раза дистиллированной водой для удаления остатков пищи. Затем взять в рот 20 мл дистиллированной воды и держать ее во рту около 2 минут. Полученную жидкость слить в стаканчик и профильтровать через бумажный фильтр. Жидкость представляет собой раствор слюны, которая содержит амилазу — фермент, катализирующий гидролиз 1,4-гликозидных связей в молекулах крахмала.

2. Сравнениекислотногоиферментативногогидролизакрахмала.

Для контроля за ходом гидролиза крахмала готовят 10 пробирок, наполненных на четверть объема дистиллированной водой с добавлением 4—5 капель раствора йода.

24

Берут две чистые пробирки и, пронумеровав их, наливают в каждую по 3 мл 1%-ного раствора крахмала. Затем в первую пробирку наливают 3 мл раствора слюны, а во вторую — 3 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и берут из каждой по 1 капле для йодной реакции. Убедившись по появлению темно-синего окрашивания в наличии нерасщепленного крахмала, обе пробирки ставят в водяную баню с температурой около 37 ºС и фиксируют время. Для контроля за ходом гидролиза через каждые 2 минуты из пробирок берут по 2—3 капли для йодной реакции. Результаты опыта записывают в виде таблицы, отмечая положительную пробу с йодом знаком «+», а отрицательную — «–».

Время

№ пробы от начала гидролиза, Крахмал + амилаза Крахмал + HCl мин

Записывают время исчезновения йодной реакции в каждой пробирке, делают выводы.

3. Специфичность амилазы.

В две пробирки налить по 1 мл раствора слюны. В первую пробирку добавить 1 мл 1%-ного раствора крахмала, а во вторую — 1 мл 1%-ного раствора сахарозы. Содержимое каждой пробирки хорошо перемешать и поместить обе пробы на 5 минут в водяную баню с температурой 37—40 ºС. Затем пробы охладить и, разделив пополам, проделать реакции с йодом и с реактивом Фелинга. Результаты записать в виде таблицы, сделать выводы.

4. Термолабильность амилазы.

В чистую пробирку отлить 2—3 мл раствора слюны и кипятить в течение 5—7 минут, после чего охладить.

25

В три пробирки налить по 1 мл 1%-ного раствора крахмала. В первую пробирку налить 1 мл прокипяченного раствора слюны, во вторую и третью — по 1 мл обычного раствора слюны. Первую и вторую пробирки поместить на 5 минут в водяную баню с температурой 37—40 ºС, а третью пробирку — в баню со льдом. После этого исследовать содержимое пробирок на реакцию с йодом.

Далее третью пробирку поместить на 5 минут в водяную баню с температурой 37—40 ºС и, охладив, исследовать ее содержимое на реакцию с йодом.

Результаты опыта записать в виде таблицы, объяснить их и сделать выводы.

5. Влияние рН-среды на активность амилазы.

В три пробирки налить по 1 мл раствора крахмала. В первую добавить 3 капли 0,1 н. раствора соляной кислоты, во вторую — 3 капли дистиллированной воды, а в третью — 3 капли 0,1 н. раствора едкого натрия. Затем во все три пробирки добавить по 1 мл раствора амилазы и поместить их на 5 минут в водяную баню с температурой 37—40 ºС. Далее в третью пробирку для нейтрализации добавляют 3 капли 0,1 н. раствора соляной кислоты, так как в щелочной среде реакция с йодом не идет. Во всех трех пробирках провести реакцию с йодом. Результаты опыта представить в виде таблицы. Сделать выводы.

6. Влияниеингибиторовиактиваторовнаактивностьамилазы.

В три пробирки налить по 1 мл раствора слюны. В первую пробирку добавить 2 капли 1%-ного раствора хлористого натрия, во вторую — 2 капли 1%-ного раствора сернокислой меди, а в третью — 2 капли дистиллированной воды. Затем в каждую пробирку добавить

26

по 1 мл раствора крахмала. Все три пробирки на 2 минуты поместить в водяную баню с температурой 37—40 ºС. После этого пробирки охладить и добавить в каждую по 3 капли раствора йода для проведения йодной пробы. Результаты опыта оформить в виде таблицы, сделать выводы.

27

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5

ЛИПИДЫ

В состав тканей животных и растений входят нейтральные жиры (триглицериды) и жироподобные соединения (липоиды). Эти соединения построены по типу сложных эфиров и выполняют в организме разнообразные функции — защитную, запасную, функцию терморегуляции организма и т. д. Из комплексов липидов с белками (липопротеидов) построены клеточные мембраны, играющие важную роль в жизнедеятельности клетки.

1. Свойства липидов

Приборы и оборудование:

1. Штатив с пробирками.

2. Большая пробирка с пробкой, в которую вставлена стеклянная трубка.

3. Водяная баня.

1.1. Гидролиз (омыление) жира. Реакция обусловлена тем, что липиды представляют собой сложные эфиры, которые в кислой или щелочной среде способны распадаться на составные части — спирт и высшие жирные кислоты. В случае щелочного гидролиза образуются натриевые (или калиевые) соли высших жирных кислот — мыла:

Ход работы. В пробирку наливают около 2 мл растительного масла и добавляют равный объем 40%-ного спиртового раствора едкого калия (или натрия). Пробирку закрывают пробкой, в которую вставлена стеклянная трубка (холодильник), помещают в кипящую водяную баню и держат там до образования однородного раствора мыла. Результат опыта и уравнение реакции записывают.

28

Далее в пробирку наливают 1 мл воды и взбалтывают. Полученный раствор делят на две части и используют для открытия составных частей жира.

1.2. Открытие в гидролизате составных частей жира:

а) открытие жирных кислот:

RCOOK + H2SO4 RCOOH + KHSO4

Ход работы. В пробирку с полученным в первом опыте гидролизатом добавляют равное количество 10%-ного раствора серной кислоты. Пробирку помещают в водяную баню до образования на поверхности жидкости жирного слоя.

б) открытие глицерина:

Ход работы. В пробирку с гидролизатом наливают 1 мл раствора щелочи и несколько капель 5%-ного раствора сернокислой меди. Появляется характерное синее окрашивание глицерата меди.

1.3. Открытие ненасыщенных жирных кислот в жире. Непре-

дельные жирные кислоты легко присоединяют галогены по месту разрыва двойных связей, что доказывается обесцвечиванием бромной воды или раствора йода:

Ход работы. В пробирку наливают 1 мл бромной воды и несколько капель растительного масла. Пробирку тщательно встряхивают и наблюдают обесцвечивание бромной воды. Результаты опыта и уравнение реакции записывают.

29

2. Количественное определение липидов методом Сокслета

Классический метод количественного определения свободных липидов по Сокслету основан на способности ряда органических растворителей (диэтиловый эфир, петролейный эфир, хлороформ, дихлорэтан и пр.) количественно извлекать свободные липиды из материала растительного или животного происхождения. Чаще всего для определения используются эфиры. В эфирную вытяжку переходят жиры (триглицериды), жирные кислоты, стеролы, лецитин, воски, эфирные масла и пр.

Экстракцию жиров проводят в автоматически действующем аппарате Сокслета. Аппарат Сокслета состоит из трех частей:

—колбы;

—пришлифованного к колбе экстрактора;

—пришлифованного к экстрактору шарикового холодильника.

После проведения анализа определить количество жиров в исследуемом веществе можно двумя способами:

1) прямым методом — путем выпаривания растворителя из колбы и взвешивания остающихся в ней экстрагированных липидов;

2) косвенным методом — по потере в массе навески в процессе экстракции из нее липидов.

30 с исследуемым веществом