Биохимия. Методические указания к практикуму по спецкурсу

числа наносимых проб и размера стакана для хроматографии. Вдоль узкой стороны на расстоянии 2—3 см от края наносят карандашом линию старта. На линию старта капиллярной пипеткой наносят каплю раствора аминокислоты. Диаметр пятна не должен превышать 5—6 мм, а расстояние между пятнами должно быть не менее 2—3 см. После нанесения пятен бумагу просушивают и помещают в герметически закрытый сосуд с растворителем. В качестве растворителя используют насыщенный раствор фенола или смесь «бутанол-1:уксус- ная кислота:вода» (4 : 1 : 5). При этом следят, чтобы бумага не касалась стенок, а конец ее был погружен ниже линии старта. Не следует допускать, чтобы растворитель поднимался до края бумаги. Когда растворитель приблизится к краю, полоску вынимают, высушивают до полного удаления растворителя и проявляют. В качестве проявителя для аминокислот используют раствор нингидрина в ацетоне.

Вычисляют значение Rf для каждой аминокислоты и сравнивают его с литературными значениями.

1.

2.

3.

4.

Литературные значения Rf для некоторых аминокислот приведены в приложении 1 (табл. 1).

12

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2

БЕЛКИ

Многие факторы влияют на физико-химические свойства белковых веществ, вызывая изменения структуры макромолекул. Данный процесс известен как денатурация. При денатурации в первую очередь происходят изменения вторичной и третичной структуры без нарушения при этом пептидных (ковалентных) связей.

Факторы, вызывающие денатурацию, можно разделить на две группы: а) физические факторы, к которым относятся высокая температура, механическое воздействие, излучение и т. д.; б) химические факторы — осаждение тяжелыми металлами, минеральными или органическими кислотами, щелочами, органическими растворителями, алкалоидами и т. д. Реакции осаждения белков бывают обратимыми и необратимыми. При обратимом осаждении молекулы белка не подвергаются глубокой денатурации, а осадок белка может быть снова переведен в раствор. При необратимом осаждении происходит глубокая денатурация белка, он теряет свойства гидрофильности и становится гидрофобным. Денатурированный белок не способен к восстановлению своих первоначальных физико-химических и биологических свойств.

1. Реакции осаждения белков

Приборы и оборудование:

1.Штатив с пробирками.

2.Спиртовка.

3.Держалка.

1.1. Осаждение белка при кипячении. Выпадение белков в осадок при нагревании — свертывание — характерно практически для всех белков. Выпадение белка из раствора легче всего происходит в изоэлектрической точке, которая для большинства белков находится в пределах рН 4,5—6,0, то есть при слабокислой реакции. В нейтральной и сильнокислой средах осаждение белка идет значительно хуже, а в щелочной среде не наблюдается вовсе.

13

Ход работы. В три пробирки налить по 1 мл раствора белка. В первую добавить 2 капли 1%-ного раствора уксусной кислоты, а во вторую 0,5 мл 10%-ного раствора едкого натрия. Содержимое всех трех пробирок прокипятить. Сравнить степень выпадения белка в осадок.

1.2.Осаждение белка органическими растворителями. Добав-

ление значительных количеств неводных растворителей может влиять на конформацию белковой молекулы. Кроме того, происходит разрушение гидрофобного ядра, так как термодинамически более выгодным становится развернутое (денатурированное) состояние.

Ход работы. В пробирку наливают 1 мл раствора белка и прибавляют 2 мл спирта (ацетона). При взбалтывании выпадает осадок белка вследствии дегидратации белковых молекул спиртом (ацетоном). Часть содержимого пробирки переливают в другую пробирку и добавляют воду до растворения осадка.

1.3.Осаждение белка органическими кислотами. Сульфосали-

циловая и трихлоруксусная кислоты являются чувствительными и специфическими реактивами на белок. Причем трихлоруксусная кислота, в отличие от сульфосалициловой, осаждает только белки и не осаждает продукты распада белков и аминокислоты. Поэтому эти кислоты часто используются для удаления белков в биологических материалах.

Ход работы. В пробирку наливают 2 мл раствора белка и 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Встряхивают, при этом белок выпадает в осадок.

1.4.Осаждение белка солями тяжелых металлов. Соли тяже-

лых металлов (Hg, Ag, Cu, Pb и др.) вызывают необратимое осаждение белков, образуя с ними нерастворимые в воде комплексные соединения. Возникновение таких комплексов обусловлено адсорбцией тяжелого металла на поверхности белковой молекулы. Поэтому белки применяют в качестве противоядия при отравлении солями тяжелых металлов.

Ход работы. В две пробирки наливают по 1 мл раствора белка.

Впервую добавляют несколько капель раствора сернокислой меди, а во вторую — несколько капель раствора уксуснокислого свинца. Наблюдают образование осадков.

14

2. Гидролиз нуклеопротеидов

Нуклеопротеиды — сложные белки, состоящие из простого белка и нуклеиновой кислоты в качестве простетической группы. Связь между белком и нуклеиновой кислотой имеет большей частью электростатическую природу, т. е. кислотные группы нуклеиновых кислот взаимодействуют с аминогруппами белков. Нуклеиновые кислоты состоят из мононуклеотидов, построенных из пентозы (рибозы или дезоксирибозы), фосфорной кислоты и азотистого основания (пуринового или пиримидинового). При гидролизе нуклеопротеиды распадаются на свои составные части. Схему гидролиза можно представить в следующем виде:

Нуклеопротеиды

Приборы и оборудование:

1.Круглодонная колба на 250 мл.

2.Обратный холодильник (шариковый).

3.Пипетка с маленькой грушей для отбора проб.

4.Маленькая аналитическая воронка с фильтрами.

Ход работы. В круглодонную колбу поместить около 1 г сухих дрожжей, прилить 150 мл 5%-ного раствора серной кислоты, закрыть колбу пробкой с обратным воздушным холодильником и осторожно кипятить смесь. Через 5 минут после начала кипения отобрать пипеткой первую пробу и исследовать ее на присутствие продуктов гидролиза. Следующие пробы отбирать через каждые 10 минут, пока не будут получены все продукты гидролиза нуклеопротеидов.

15

Исследование проб. Каждую пробу охладить, профильтровать и в фильтрате определить продукты гидролиза нуклеопротеидов.

Белок и полипептиды определить по биуретовой реакции. К 0,5 мл фильтрата добавить равное количество раствора щелочи и 2—3 капли раствора сернокислой меди. При взбалтывании, при наличии белка или полипептидов, появляется сине-фиолетовое окрашивание.

Фосфорную кислоту определяют молибденовой пробой. К 0,5 мл фильтрата добавить 5 капель молибденового реактива и нагреть до кипения. В присутствии фосфорной кислоты образуется желтый кристаллический осадок фосформолибдата аммония:

12(NH4)2MoO4 + H3PO4 + 21HNO3 =

= (NH4)3PO4 12MoO2 + 21NH4NO3 + 12H2O.

Наличие углеводов (пентоз) определить по реакции с реактивом Фелинга: 0,5 мл фильтрата нейтрализовать содой (до прекращения выделения углекислого газа) и добавить 4—5 капель реактива Фелинга, нагреть. В присутствии пентоз образуется красновато-кирпичный осадок оксида меди (I).

На пуриновые основания проводят серебряную пробу: к 0,5 мл гидролизата добавляют раствор аммиака до щелочной реакции (примерно 2—3 капли) и добавляют 5 капель аммиачного раствора азотнокислого серебра. В присутствии пуриновых оснований появляется бурый осадок их серебряных соединений. Иногда образование осадка происходит спустя некоторое время.

Результаты записать в виде нижеследующей таблицы.

Результаты исследования гидролизата нуклеопротеидов

16

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3

ОБМЕН БЕЛКОВ

Белки выполняют в организме главным образом структурную функцию и играют важную роль в пластическом обмене. В процессе жизнедеятельности непрерывно происходит распад и обновление тканевых белков, синтез ферментов и других необходимых организму веществ. Организм человека нуждается в постоянном поступлении с пищей белков, которые в процессе пищеварения распадаются до низкомолекулярных пептидов и аминокислот. Последние принимают участие в синтезе тканевых белков и биологически активных веществ белковой природы. Аминокислоты, не использованные для биосинтетических процессов, утилизируются. Выделяющийся в результате утилизации аммиак, будучи ядовитым для организма веществом, обезвреживается путем синтеза мочевины в печени, образования глутамина в различных органах и путем синтеза аммонийных солей в почках.

1. Анализ биологической полноценности белков суточного рациона по аминокислотному составу

Состояние белкового обмена зависит от множества факторов. Существенное влияние на белковый обмен оказывает характер питания, в частности белковый состав пищи. При недостаточном поступлении белков с пищей распад тканевых белков организма превосходит их синтез. Большое значение имеет качественный аминокислотный состав пищевых белков. Некоторые аминокислоты могут синтезироваться в организме человека и животных из других органических веществ и не обязательно должны поступать в готовом виде вместе с пищей. Такие аминокислоты получили название заменимых в отличие от незаменимых аминокислот, которые не синтезируются в организме и должны поступать извне, как правило, в составе пищевых белков. Отсутствие или недостаток в пище какой-либо незаменимой аминокислоты приводит к нарушению биосинтеза различных белков, со-

17

провождается задержкой роста, падением веса тела и вызывает ряд общих патологических изменений в организме. Принимаемые с пищей белки значительно отличаются друг от друга по своему аминокислотному составу и биологической ценности. Чем ближе аминокислотный состав принимаемого пищевого белка к аминокислотному составу белков организма, тем выше его биологическая ценность. К продуктам, содержащим белки с высокой биологической ценностью, относятся мясо, рыба, яйца, творог, сыр и др. Белки, содержащиеся в веществах растительного происхождения, несколько уступают животным белкам как по степени усваиваемости в организме, так и по аминокислотному составу.

При определении качества белков рационов по аминокислотному составу особое значение имеет сбалансированность аминокислот, т. е. оптимальное для усвоения соотношение между ними. При определении аминокислотного состава рационов обычно ограничиваются расчетом незаменимых аминокислот, содержание заменимых оценивают суммарно (белок минус сумма незаменимых аминокислот).

Ход работы. По формуле сбалансированного питания (табл. 3 прил. 1) и по таблице аминокислотного состава пищевых продуктов (табл. 4 прил. 1) требуется охарактеризовать биологическую полноценность белков суточного рациона по аминокислотному составу.

Состав суточного рациона № 1: молоко коровье стерилизованное 300 г, творог нежирный 50 г, говядина средней жирности 100 г, треска свежая 70 г, мука ржаная 80 г, мука пшеничная 120 г, просо 50 г, картофель 300 г, капуста белокочанная 300 г.

Используя данные таблицы 4 приложения 1 вычисляют содержание белка и аминокислот по каждому продукту, указанному в суточном рационе.

Пример расчета

Молоко коровье стерилизованное:

100 г содержат 3,5 г белка (по табл. 4 прил. 1), 300 г — Х г белка,

отсюда Х 3,5 300 10,5 г белка в 300 г молока. 100

3,5 г белка содержат 37 мг триптофана (по табл. 4 прил. 1), 10,5 г

белка — Х мг триптофана, отсюда Х 10,5 37 111 мг триптофана в

3,5

300 г молока.

18

Аналогичные пропорции решают и для других аминокислот. Полученные данные заносят в нижеследующую таблицу.

Результаты расчета количества белка и аминокислот в рационе

Суммируют содержание белка и каждой аминокислоты во всех продуктах суточного рациона.

Полученные результаты сравнивают с соответствующими показателями формулы сбалансированного питания (табл. 3 прил. 1). Дают заключение, отвечают ли найденные количества белка и аминокислот дневной потребности в них. Отмечают долю животных белков в процентах. Оценивают сбалансированность аминокислотного состава белков данного суточного рациона.

Состав суточного рациона № 2: молоко коровье стерилизованное 300 г, свинина жирная 100 г, треска свежая 50 г, мука ржаная 100 г, мука пшеничная среднего выхода 100 г, просо 50 г, картофель 500 г, капуста белокочанная 300 г, свекла 100 г.

Расчет для рациона № 2 производят так же, как и для рациона № 1. Оценивают найденное содержание белков в суточном рационе № 2 по их количеству и доле животных белков (в %). Делают заключение о сбалансированности аминокислотного состава белков данного суточного рациона и сравнивают ее с данными по суточному рациону № 1.

2. Гидролиз белков

Основной связью аминокислотных остатков друг с другом в белке является пептидная связь. Расщепление пептидной связи может происходить как под действием протеолитических ферментов живого организма (ферментативный гидролиз), так и под действием кислот или щелочей при нагревании.

19

Вкачестве промежуточных продуктов гидролиза белка получаются сначала высокомолекулярные продукты — пептоны и полипептиды, затем более простые пептиды и дипептиды. Конечными продуктами гидролитического расщепления белка являются аминокислоты.

При кислотном гидролизе помимо аминокислот образуются иминокислоты (пролин и оксипролин), аммиак, сероводород и некоторые продукты взаимодействия образующихся аминокислот с минеральными кислотами. Это обеспечивает темную окраску кислотных гидролизатов белка.

Ворганизме гидролиз белков постоянно протекает под влиянием специфических ферментов и играет важную роль в процессах пищеварения и внутриклеточного обмена. Гидролиз белков широко применяется для определения их аминокислотного состава, при суждении о полноценности белковых пищевых продуктов, а также для получения гидролизатов, используемых в медицинской практике.

Впроцессе гидролиза, вследствие разрыва пептидных связей в белке, в реакционной смеси происходит нарастание одновременно карбоксильных и аминогрупп в эквивалентных количествах. Количество освобождающихся аминогрупп можно определить методом формольного титрования Серенсена. Этот метод основан на свойстве

-аминогрупп аминокислот вступать во взаимодействие с формальдегидом с образованием метиленовых производных аминокислот. В результате этой реакции аминогруппы блокируются формальдегидом и теряют свои основные свойства. Карбоксильные же группы в метиленаминокислотах сохраняются без изменения и могут быть оттитрованы щелочью:

H2C NCH COONa

R

Количество титруемых карбоксильных групп эквивалентно числу связанных формальдегидом аминогрупп.

Таким образом, результат титрования указывает на содержание аминогрупп. Окончание гидролиза будет совпадать с моментом прекращения прироста амино- и карбоксильных групп в гидролизате.

20