2 курс / Нормальная физиология / Ликвор_как_гуморальная_среда_организма_Пикалюк_В_С_,_Бессалова_Е

выбраковывался, если при взятии, визуально, жидкость была мутная или имелась примесь крови. От одного животного-донора получали 100-150 мл спинномозговой жидкости, в зависимости от упитанности и возраста животного. После взятия ликвора пробки флакона обрабатывались 10% раствором йода и коллодием, колпачки покрывались металлексом. Весь процесс получения спинномозговой жидкости проходил в стерильных условиях. Посуда, инструментарий, перевязочный материал, вакуумные шланги, иглы обрабатывали согласно общепринятым правилам асептики в хирургии. При последующем заборе ликвора процесс повторялся в тойКже последовательностиафедра.

Значительно упрощ ет и ускоря т забор ксеногенной СМЖ использование нами стерильных одноразовых станд ртных систем ПК-11-01 вместо в куумного шланга (8), иглы Дюфо (9) и

стеклянного окна (11). Преимущество предложенного нами забора состоитнормальнойв т м, что отпад ет необходимость в повторной стерилизации системы, это позво яет быстро производить

массовый заб р ликво а со строгим соб юдением правил асептики, так как система использовалась у животного однократно.

Прозрачныйанатомматери л всех элементов системыиизажим давали возможность визуаль о быс ро к нтролировать качество и скорость поступле ия жидкос и во флакон при появлении примеси крови позволял своевременно прекрат ть поступление ликвора в приемник. Количество спинномозговой жидкости у одной особи крупногоКГМУрогатого скота составляет 300-320 мл. Ликвор коров бесцветен и визуально не отличается от ликвора человека. Кроме того, он приближается к последнему по своему морфологическому составу, по биохимическим и физикохимическим константам. Спинномозговая жидкость, полученная при люмбальной пункции, в норме прозрачна, бесцветна, она имеет постоянный удельный вес 1,006-1,007 (удельный вес ликвора из желудочков головного мозга – 1,002-1,004). Вязкость СМЖ в норме колеблется от 1,01 до 1,06 спз. Спинномозговая жидкость имеет слабощелочную среду (pH 7,4-7,6). Длительное хранение ликвора вне организма при комнатной температуре приводит к постепенному повышению его pH.

62 ЛИКВОР КАК ГУМОРАЛЬНАЯ СРЕДА ОРГАНИЗМА

Прижизненно полученную спинномозговую жидкость на донорских пунктах подвергали консервированию с использованием различных технологических цепочек.

Первый вариант. Флаконы с ксеногенной спинномозговой жидкостью помещали в специальные контейнеры, предназначенные для транспортировки крови и доставляли на Крымскую республиканскую станцию переливания крови (КРСПК), где замораживали в холодильниках типа при t -40ºC; - 70ºC и хранили до 7 дней и более. Целью данного способа консервации являлось стемление сохранить по возможности максимальноеКколичествоафедрБАВ ликвора. П и низкихатемпературах физиологические процессы в кл тках и жидкостях ингибируются, происходит анабиоз, витри икация [229].

Второй вари нт. На донорских пункт х в специальной

комнате ликвор из стеклянных флаконов расфасовывали в стерильнормальнойые алюминиевые тубы емкост ю до 200 мл, которые приобретали на станции искусственного осеме ения животных, где

они исп льзуются для хранения семе и животных в криоконсервированном состоянии. Спинномозговую жидкость в тубах консервировалианатсверхбыстрымомииза ораж ван ем при t -196ºC путем погруже ия в сосуды Дюара-311 ли СДС-5 с жидким азотоми н пр вляли на КРСПК.

Третий вариант. На д норских пунктах исходное лекарственное сырье поступало в стерильные пластикатные системы ПК-11-01КГМУдля забора крови и подвергалось в течение 2 минут замораживанию путем погружения в ванну с жидким азотом, после чего переносили его в сосуды Дюара-31 или СДС-5 с жидким азотом при t -196ºC и отправляли на КРСПК.

Таким образом, были разработаны технические регламенты прижизненного получения исходного лекарственного сырья, его криоконсервирования при различных режимах низких температур. Был создан криобанк ксеногенной спинномозговой жидкости для получения биопрепарата.

Часть ликвора брали из холодильников и оттаивали его при комнатной температуре в течение 24 часов. Размороженный ликвор подвергался экологической экспертизе в КРСПК, в Крымской РСЭС и в Крымской ветеринарной лаборатории. Определяли:

1)мощность экспозиционной дозы внешнего γ-излучения, определялась поверхностная радиоактивная загрязненность, суммарная удельная активность β-излучающих нуклидов, радионуклидный состав, содержание цезия-137;

2)содержание солей тяжелых металлов, ядохимикатов, гербицидов, пестицидов, фунгицидов, нитратов, нитритов;

3)содержание антибиотиков: пенициллина, стрептомицина, тетрациклина, гризина;

4)проводили реакции: RW, ВИЧ-1, ВИЧ-2, на австралийский антиген, РИД на нейролейкоз.

После полуКченияаотрицательногофедрарезультата экологической экспертизы, КСМЖ в замороженном состоянии н правляли в Белгород-Днестровский завод м дицинских изделий Одесской области для γ-стерилиз ции, которую проводили в транспортной

таре в контейнерах на промышленной γ-установке «Стерилизатор- 3» в теченормальнойие 3 часов п и экспозиции 1,5 Мрад. Часть ксеногенной СМЖ в ко тейнерах направляли в Институт биофизики МЗ СССР

(г. Москва), где ее подвергали γ-стерилизации (2,5 Мрад) на аппарате ЭГО-2. При таком режиме стернилизации происходит

обезвреживаниеанатомииб ктерий, вирусов, пухолевых клеток, грибковых мицелл, лейкозных бл стов и актино икозных м целл при

сохранении биологической полноценности ликвора. В основу γ- стерилизации легли положения, разработанные рядом авторов

доставляли на КРСПК, где сохраняли в криоконсервированном состоянии: в низкотемпературных холодильниках при t -40ºC; - процессе происходит криопреципитация

исходного сырья и снижение его антигенных свойств.

По истечении 7-10 дней ксеногенную СМЖ извлекали и размораживали при комнатной температуре в течение 24часов. После разморозки ликвор подвергали центрифугирванию в

передавали в бокс для отделения центрифугата от осадка с соблюдением правил асептики и антисептики. Стерильный центрифугат повторно подвергался замораживанию в низкотемпературном холодильнике типа при t -70ºC. Через 7 дней

64 ЛИКВОР КАК ГУМОРАЛЬНАЯ СРЕДА ОРГАНИЗМА

центрифугат вновь повторно подвергался оттаиванию при комнатной температуре в течение 24 часов. Быстрое замораживание нарушает биохимические и биофизические процессы в клетках, что приводит к потере сенсибилизирующих свойств [229]. При неоднократном замораживании и оттаивании ликвора происходит депротеинизация, аутолизирование, самоощелачивание и снятие общей сенсибилизации путем распада крупных биополимеров на низкомолекулярные.

Затем центрифугат фильтровали через стерилизующие фильтры «Милипор» (номинальный диаметр пор 0,8; 0,45;

0,22 мкм) Кафедрапри д влении 0,2-0,4 атм. Гамма-стерилизация и фильтрат (

вторичная стерилиз ция через фильтры «Милипор» не снижает

биологической ктивности ликвора ко ов [183]. Стерильный

ликвор, проведенный через фильтры «Милипор»)

разливали в стеклянные ампулы по 2; 5; 10 мл и в стеклянные флаконормальнойы по 20; 50; 100; 150; 250; 500 мл. Проводили бакконтроль на стерильн сть. Осуществляли био огический к нтр ль препарата

на пирогенн сть, токсичность, л ергенность а кр ликах, морских свинках и

белых мышах. Определяли физико-химические

показателиа: цветнатом, прозр чность, запах, раствориимость в воде, в органических растворителях, прело ляемость, pH, количество белка, стойкость преп р та при хранении, условия срок хранения. Готовый перп рат этикировали, укупоривали в картонные коробки или специальную тару. Биопрепарат хранили при температуре +20ºC, в защищенномКГМУот света месте. Срок годности – 3 года.

В отличие от вышеуказанных исследователей, нами впервые была разработана и обоснована технология получения биологического препарата на основе спинномозговой жидкости лактирующих коров, включающая в себя целую цепочку технологических процессов:

1)в качестве животных-доноров впервые использовали только лактирующих коров, ликвор которых содержит максимальный спектр биологически активных веществ;

2)для прижизненного забора ксеногенной спинномозговой жидкости использовали пластиковые системы ПК-11-01, предназначенные для консервирования крови; преимущество их состоит в том, что спинномозговая жидкость поступает непосредственно в стерильный пластикатный мешок (емкостью 500

мл), что исключает необходимость производить разлив во флаконы

иалюминиевые тубы; при сверхбыстром глубоком замораживании

идальнейшем хранении в сосудах Дюара с жидким азотом пластикатный мешок с СМЖ не подвергался разрывам, в отличие от стеклянных флаконов и алюминиевых туб;

3)γ-стерилизации подвергали исходное лекарственное сырье – ксеногенную спинномозговую жидкость, в отличие от других исследователей, которые проводили γ-стерилизацию препарата после проведения спинномозговой жидкости через фильтры «Милипор» в готовом виде (флаконы и ампулы); такой метод не обеспечивал полнойКафедрстерильности, часто наблюдалисьапомутнение ликвора, выпадение ос дка, хлопьев и т. .;

4)впервые проводили экологич скую экспе тизу ксеногенной спинномозговой жидкости крупного скота на содержание

радионуклидов, солей тяжелых металлов, ядохимикатов, пестицинормальнойдов, гербицидов, фунгицидов, нитратов и нитритов, определялось соде жание нтибиотиков (пенициллина,

стрептомицина, тет ациклина, гризина), проводилась реакция на

ВИЧ-1, ВИЧ-2, австралийский антиген, РИД на нейролейкоз;

5) применилианатомиитрехкр тное зам раживан е трехкратное оттаивание с целью с ижения антигенных свойств ксеногенного

ликвора и двукрат ое центрифугир вание с целью удаления балластных веществ;

6) предложили вторичную стерилизацию ксеногенной спинномозговой жидкостиКГМУпутем ее проведения через фильтры «Милипор» (первичная стерилизация – радиационная). Такой способ технологической обработки спинномозговой жидкости крупного рогатого скота гарантирует полную стерильность препарата в течение 3 лет и более, так как за этот период не наблюдалось бактериальной, микоплазменной, грибковой и вирусной контаминации и не снижалась его биологическая активность.

Поскольку требования низкой токсичности имеют большое клиническое значение, нами были проведены комплексные исследования ксеногенной спинномозговой жидкости по выявлению возможных тератогенных и эмбриотоксических свойств. Полученные нами данные показали, что ликвор не обладает вышеуказанными побочными действиями [175].

Таким образом, нами был получен биологический препарат, представляющий собой фильтрат из прижизненно взятой криоконсервированной γ-стерилизованной спинномозговой жидкости крупного рогатого скота (лактирующих коров), который использовали для проведения дальнейших экспериментальных исследований.

Предложенная технология получения, последовательной обработки (криоконсервация, γ-стерилизация, фильтрация) и хранения ксеногенной спинномозговой жидкости отличается относительной простотой, не требующей дорогостоящей аппаратурыКафедраи созд ния дополнительных специализированных служб, а сырьевая б за получения исхо ного лек рственного сырья является доступной, экологич ски чистой, с возможностью многократного использования животных-доноров. В связи с этим

возникает возможность создания в перспективе специализирнормальнойванной ксеноликворо огической службы (центра) с пунктами прижизненного з бора СМЖ круп ого р гатого скота в

живот ов дческих хозяйств х и на мясокомби атах с последующей ее обработкой и хранением на базе уже существующих станций переливанияанатомкрови. Это позволяет создатьикр иобанк ксеногенной спинномозговой жидкости крупн го рогатого скота с последующим выделением из ликвора би л гически акт вных веществ и возможностью получения новых б опрепаратов для здравоохранения, ветеринарной медицины и животноводства с учетом потребностейКГМУне только Украины, но и других стран.

1.5. Строение и функциональное значение гематоэнцефалического барьера, его роль в регуляции состава спинномозговой жидкости, понятие о «гуморальном рефлексе»

Гематоэнцефалический барьер. Нигде зависимость от постоянства внутренней среды так не выражена, как в мозге. В других органах внеклеточная концентрация гормонов, ионов, аминокислот подвержена частым небольшим изменениям. Если бы такие изменения происходили в ЦНС, это сопровождалось бы неконтролируемой активностью нейронов. Надежную изоляцию

мозга от колеблющихся изменений состава крови осуществляют системы неспецифических барьеров. Существует также специфический иммунный барьер мозга, представленный автономной системой иммунокомпетентных клеток [145]. Различные авторы выделяли несколько вариантов неспецифических тканевых защитных механизмов мозга. Термин гематоэнцефалический барьер предложили Эрлих, Левандовский, Штерн, термин гематоликворный барьер – Вальтер, Шпатц, Кафка,

плексо-менингеальный барьер – Монаков, центральный нервный барьер – Шамбуров, защитные механизмы ЦНС – Фридман [248].

В настоящееКафедравремя доминирует п едст вление о множественности барьерных механизмов в ЦНC. Большинство

современных авторов описывают три барьерные структуры ЦНС. 1) Гематоэнцефалический барьер, он включает три компонента:

двухмембранный слой эндотелиоцитов, базальную мембрану капилляровнормальной, имеющую фибриллярные и клеточ ые (перициты) компоне ты и аст оцитарную муфту, покрывающую до 90%

поверхности с судов озга. 2) Гематоликворный барьер (эндотелий капилляров и его базальная мембрана, перикапиллярное пространство,анобразованноеатомиисоединительной тканью pia mater, базальная мембр на эпендимы и сл й хорио дных эпендимных клеток). 3) Ликвор омозговой барьер (pia mater, покрытая менинготелием, наружн я пограничная глиальная мембрана из астроцитов). Ряд авторов называют ликворно-мозговой барьер ликворно-тканевым барьеромКГМУ, Г.Н. Крыжановский (1997) описывает еще глионевральный (глионейрональный) барьер. Иногда термин гематоэнцефалический барьер рассматривают как родовое, анатомо-физиологическое и историческое понятие внутри которого возможны и видовые термины типа гематоликворный, ликворномозговой барьеры, то есть описывают ГЭБ как собирательное понятие защитных механизмов мозга [222]. Хорошо изучены и описаны морфологические, физиологические и биохимические характеристики ГЭБ в норме [250]. Эндотелий капилляров мозга не имеет пор, в месте контактов эндотелиальных клеток, глии с мембранами нейронов имеются уплотнения, непроницаемые для веществ с высокой молекулярной массой, которые являются одним из морфологических субстратов ГЭБ.

Большинство веществ проникают в СМЖ не между эндотелиоцитами, а сквозь них [266, 286, 462].

Изучение функции ГЭБ привело к открытию своеобразного антагонизма реакции центра и периферии. Выражается он в том, что ряд БАВ вызывает при непосредственном воздействии на нервные центры (непосредственно в СМЖ, в обход ГЭБ) реакцию организма, противоположную той, которую они вызывают при введении в общую циркуляцию. Такая реакция организма на одно и то же вещество имеет определенное значение для понимания регуляции физиологических процессов, в частности, ауторегуляции [98, 212]. СледуетКафт кже учестье, чтодраодни и те же БАВ могут синтезироваться в ЦНС и на п риферии, выполняя различные функции [19]. Это имеет важное физиологическое значение и является основой для осуществл ния регуляторной функции ГЭБ

[106, 210]. Так, мелатонин при подкожном и внутрибрюшинном введенормальнойии не казывает стимулирующего влия ия на гипофиз, но при введении его в боковой же удочек стимулирующий эффект

четко выражен. В гипофизотрофной зо е гип таламуса не

содержится чувствительных к мелатонину структур, стимулирующиханатомиифу кцию гип физарно-надпочечн ковой системы, так как при введе ии этого амина в боковой желудочек мозга на

фоне де ффере тации медиально-базального гипоталамуса активирующий эффект не проявляется [150]. Установлено также различие в эффектах мелатонина на цикл сон-бодрствование при внутрижелудочковомКГМУи внутривенном введении, что подтверждает теорию выработки мелатонина в виде двух порций – в кровь и в ликвор, для связывания с рецепторами мозга [105]. Увеличение или уменьшение содержания катехоламинов в ликворе 3-го желудочка оказывает влияние на миграцию и дифференцировку гормонпродуцирующих нейронов у крыс, на секрецию рилизингфакторов и гормонов аденогипофиза (ЛГ, ФСГ, СТГ и пролактина); а изменение содержания серотонина влияет на секрецию ЛГ, ФСГ, ТТГ и АКТГ [52, 417]. Сдвиги в составе СМЖ вследствие интравентрикулярного введения нейромедиаторов вызывают изменения функционального состояния надпочечников, щитовидной и половых желез [167]. Эффекты от периферического введения этих БАВ отличаются от центральных эффектов, что

также подтверждает теорию антагонизма действия гормонов по обе стороны мозгового барьера.

Строение ГЭБ с некоторыми вариациями сохраняется во всех отделах головного мозга, кроме так называемых зон «недостаточности» ГЭБ, имеющих важное физиологическое значение. Они расположены в зонах, объединенных под названием перивентрикулярной (циркумвентрикулярной) области, максимально контактирующих с ликвором: в гипоталамусе вокруг нейросекркторных ядер, срединного возвышения, а также в области гипофиза, субфоникального органа, эпифиза. Это, так называемые, «окна мозга», имеющиеКафбольший доступедрак гематогенным факторам [139]. Здесь под баз льной мембраной имеются перикапиллярные пространства, а сам б рьер обильно фенест иров н. В этих областях мозга выявляют нейроантит ла, а БАВ проходят из крови

в интерстициальную жидкость и наоборот, что обеспечивает активныйнормальнойобмен веществ ежду кровью и мозгом [72, 118, 145]. В этих участках имеется дефицит не только ГЭБ, но и

глионейро альн го ба ьера. При введении в кровь витальных красок, они окрашивают участки мозга с высокопроницаемым барьером и анасосудистое сплетоение третьегомижелудочкаи, но не проникают в ост ль ые отделы нервной системы. Соотношение окон и участков с ГЭБ по д нным нек торых авторов 1:100 или 1: 5000 [139]. Около этих струк ур нах дятся л кворные карманы, замедляющие ток жидкости и способствующие увеличению концентрации и времениКГМУконтакта БАВ с рецепторами [142]. В перивентрикулярных структурах возможна не только рецепция, но и синтез БАВ.

Современные исследования направлены на изучение процессов межклеточного взаимодействия в ГЭБ и объяснение функционирования разнородных элементов барьерных систем подобно единой клеточной мембране, играющей не только защитную, но и регуляторную роль [62].

Регуляторная функция СМЖ и структур ГЭБ, понятие о гуморальном рефлексе. В основе учения о нейрогуморальной регуляции лежат работы Штерн Л.С. Ликворная система выполняет следующие основные функции в обеспечении нейрогуморальной регуляции: 1) транспорт несвязанных гормонов периферических эндокринных желез из общей циркуляции в ликвор (через ГЭБ, в

основном в области хориоидного сплетения) и из него в гипоталамус и гипофиз; 2) поступление в ликвор гормонов из гипоталамуса, гипофиза, эпифиза с последующим влиянием на рецепторные образования мозга либо периферические железымишени (дополнительный путь из СМЖ в кровь) [142].

Таким образом, СМЖ является важным звеном в цепи гуморальных связей между ЦНС и периферией благодаря постоянному переходу в нее из общей циркуляции метаболитов, выделяемых различными органами. Как видно, ГЭБ, являясь регулятором состава СМЖ, играет в этом процессе важнейшую

роль не толькоКафедрав отношении контроля пе ехода из крови в СМЖ различных веществ и защиты н рвных центров от чуждых и

вредных веществ, но и относит льно регулиров ния перехода в кровь различных метаболитов нервных центров [262]. ГЭБ

обладает удивительной пластичностью, благодаря которой возможнормальнойо с здание и сохранение динамического г меостаза в ЦНС. ГЭБ морф функционально представляет с б й барьерно-

транспортную систе у, обл дающую высок й селективной проницаемостью для различных веществ, при этом компоненты ГЭБ, функционируяанкак единоетомицел е, са и обладаютирегуляторной функцией, влияя проницаем сть олекул ф зиологически активных веществ.

Роль мозга в гумор льной регуляции функц й организма была впервые детально изучена Л.С. Штерн, она же разработала положение о гуморальномКГМУрефлексе: «Деятельность центральной нервной системы сопровождается образованием определенных веществ, которые, переходя в цереброспинальную жидкость… бесспорно оказывают влияние на функциональное состояние и деятельность отдельных участков центральной нервной системы, устанавливая таким образом координацию функций отдельных участков. Переходя в общую циркуляцию, эти же вещества могут оказывать непосредственное влияние на периферические органы и физиологические системы. Таким образом, мозг, помимо своей специфической функции как центр и источник нервных импульсов, регулирующих активность отдельных органов и систем, принимает участие, наравне с другими органами, своими метаболитами в регуляции и координации функций организма» [262].