книги из ГПНТБ / Титаев А.А. Эволюция органических соединений на Земле. От углерода до биополимеров

творе в присутствии фосфорной - кислоты нуклеотиды не синтези­ ровались. Синтез удалось осуществить, когда взамен фосфорной кислоты был применен этилметафосфат, который обладает способ­ ностью активировать карбонильные, гпдроксильпые и аминные

цидными лампами (максимумом излучения 2537 А) при 40 + 2° С. По окончании облучения продукты реакции были изучены и иден­ тифицированы путем хроматографии — двухмерной на бумаге, тонкослойной и ионообменной. Было установлено образование аденозинмоиофосфата пз адеиозипа, адепозпндпфосфата из аденпловой кислоты и аденозиптрифосфата из аденозиндифосфата в при­

клеотпдов с применением метаморфных эфпров — этплполпметафосфата и др. Метафосфориый эфир можно синтезировать из обыч­ ного диэтилового эфира и пятиокиси фосфора по обычным прави­ лам этер1гфикации, но в мягких условиях (при -f- 60°, при отсут­ ствии воды, в растворителе типа хлороформа).

Синтез адеиозипа из адешпта и рибозы, дезоксиаденозина из адеинпа и дезоксирибозы ведут в присутствии избытка метафосфорного эфира при рН 1,15. Конденсация завершается в течение одного часа, но затем реакция идет в обратном направлении. В реакции используется только 20—40% прибавленного в смесь сахара. В присутствии рибозы получают |3-аденозин, в присутствии дезоксирибозы — (3-дезокспадеиозин.

Метафосфориый эфир способствует также фосфорилированию

эффективным и в процессе полимеризации нуклеотидов. В реакции применялись готовые препараты рибоиуклеотидов, например 2', З'-уридиловая кислота. Полученный синтетический продукт представлял собой, как пишет Шрамм, смесь компонентов различ­ ного молекулярного веса, которую можно было разделить на ко­ лонках из сефадекса или ДЭАЭ-целлюлозы. Высокомолекулярные полинуклеотиды, полученные после диализа в остатке, составили

в основном получены и Н. К. Кочетковым [204]. Однако синтези-

ронянные препараты были в значительной степени резистентны к действию рибонуклеазы. Следовательно, фосфатные группы в син­

Шрамму удалось показать, применяя фосфодиэстеразу змеиного яда, что в его препаратах имеются полннуклеотпды и с нормальным положением фосфатных групп. Синтезированная этим автором полиуридиловая кислота обладала кодирующей активностью по отношению к фенилалашшу в бесклеточиой системе Esherichia coli. Автор показал также, что добавление комплементарной полнадениловой кислоты в качестве матрицы приводит к ускорению реакции образования полпурндиловой кислоты в 10 раз. При этом

Следует заметить, что в этой реакции добавление полиуридиловой кислоты не оказало влияния на скорость полимеризации урпдиловой кислоты.

Все же, видимо, некоторые нуклеотиды могут ускорять обра­ зование комплементарных нуклеотпдных цепей, и в этом Шрамм усматривает элементарный, зачаточный матричный процесс.

Конденсация цитидиловой кислоты в полимер была легко осу­ ществлена в простых экспериментальных условиях [86J: смешивали мононуклеотид — цнтндиловую кислоту — с полифосфориой кис­ лотой и нагревали смесь при 65° в течение 1—2 час. при ограни­

ловой кислоты (цитидинмоиофосфат) по спектральной характерис­ тике и гиперхромному эффекту был сходен с натуральными полинуклеотидами. Однако по результатам действия на него фосфатазы и рибонуклеазы он был охарактеризован как смесь ди- и тринуклеотидов цитидпна [86]. Таким же методом был получен полиаденилат.

Как видно из сказанного, с помощью метафосфорного эфира в модельных опытах из предшественников довольно успешно были синтезированы нуклеозиды, нуклеотиды и полинуклеотиды. Пред­ полагается, что таким способом могли синтезироваться и нуклеи­ новые кислоты. Механизм конденсации в двухкомпоиентной систе­ ме при участии метафосфорного эфира заключается в замещении фосфатом гидроксильной группы одного из двух компонентов

споследующим отщеплением активирующей группы одновременно

сотщеплением протона от второго компонента. По этой схеме, например, активированная ОН-группа рибозы реагирует с активи­

рованным азотом адеиина, в результате чего образуется адеиозин [71].

82

Слабым звеном в теории образования нуклеиновых кислот при участии метафосфорного эфира является непременное требование отсутствия воды для успешного осуществления реакций полиме­ ризации. Если в самом деле такие условия существовали на перво­ бытной Земле и на ней были области, лишенные воды, то для об­

химическая эволюция протекала в «первичном бульоне», т. е. в водном растворе.

Шрамм предполагает, что свободная от воды область могла находиться внутри коацерватов А. И. Опарина пли подобных им

ного эфира. Сомнительно также, мог ли существовать на первич­ ной Земле в сухих местах при 60° (температура реакции) дпэтило­

коацерватных каплях недостаточно убедительно. Коацерваты могли образоваться лишь в водной среде. Следовательно, вопрос в отношении участия метафосфорного эфира в синтезе нуклеино­ вых кислот на первичной Земле остается неясным или же на пего следует ответить отрицательно [143].

Термический синтез полинуклеотидов, осуществленный Фок­ сом и сотрудниками, заслуживает, несомненно, внимания, как со­ ответствующий реальным условиям предбиологической эры на Земле.

катализа с применением белой глины в качестве адсорбента. На­

белка — применяли температуру 37°, продолжительность опыта в этих случаях составляла 24—72 часа. Кроме белой глины обя­ зательным участником реакции были восстановители — обычно глютатион восстановленный. В некоторых случаях последний за­ меняли на гидросульфит натрия (Na2 S2 04 ), иногда пользовались водородом in statu nasceudi (цинковая пыль и НО) .

В основном в этих условиях с применением соответствующих модификаций инкубационной смеси были синтезированы нуклеи­ новые кислоты, их предшественники, белковоподобные вещества, белки с ферментными свойствами, ди- и полисахариды, высшие жирные кислоты, глицериды.

Синтез аденина. Инкубационная смесь для синтеза адеиина содержала наряду с белой глиной 10 мг KCN, 20 мг глютатиопа восстановленного, 1 н. NH4 OH или НС1 по 0,5 мл. Опыт проводили при 70° в течение 2—20 час. в герметически закрытых пробирках. Определение продукта реакции было выполнено методом хрома­ тографии на бумаге с разделительной смесью бутаиол, уксусная ледяная кислота, вода ( 4 : 1 : 5). Экстракцию пятен, обнаружен­ ных на хроматограмме в ультрафиолете, вели в 0,01 н. НС1 в те­ чение ночи в холодильнике при 0°. Светопоглощение элюатов из­ меряли иа спектрофотометре при 260 им. Ниже даны сведения о результатах синтеза аденина из HCN при различном составе инкубационной смесп:

инкубации с наибольшим выходом в полной кислой смесп. В отсут­ ствие глютатпона выход был значительно снижен, как и в отсут­ ствие глины пли обоих этих ингредиентов.

Кроме пятиа аденппа с Rf 0,5 на хроматограммах присутство­ вало еще пятно с Rf 0,3, соответствующее положению свидетеля урацпла. Других оснований не было обнаружено (рпс. 8). При хроматографии продукта реакции в некоторых смесях иа хромато­ граммах выявилось пятно с красной флуоресценцией RC 0,1—0,2, относившееся, по-видимому, к производным порфирина.

Итак, в условиях нашего эксперимента возможен синтез аде­ нина из тех же исходных веществ, какие применялись другими исследователями для той же цели [190, 191, 193, 205].

Синтез нуклеотидов. В первой части этого исследования выясняли возможность образования нуклеотидов из нуклеозидов и фосфатов. Методика проведения эксперимента в основном не отличалась от вышеописанной и состояла в инкубации смеси реа­ гирующих веществ в присутствии белой глины и восстановленного глютатиопа при 37 и 80° в течение 20 н 2 час. соответственно. В ин­ кубационную смесь, содержащую 200 мг глины и 1 мл воды, до­ бавляли какой-либо из нуклеозидов — аденозин, цитидин, уридин

без обработки, осадок элюировали 1 и. NH 4 OIi . Элюат сгущали теплым воздухом до известного объема. Эквивалентные порции

84

п смесях различного состава в процентах от взятого в опыт аденозпна (50—100 мкмоль):

Представленные данные с очевидностью указывают, что в при­ мененных нами условиях совершается, и подчас весьма интенсив­ но, фосфорплпроваипе пуклеозида аденозина с образованием моно-,

фосфатов более чем вдвое. В отсутствие глютатиоиа выход снижал­ ся до 0—5 п 10—15 % при замене глютатиоиа на гидросульфит

лиурпдиловой н полнцптпдиловой кислот) уже осуществлен в абио­ генных условиях в бесфермептпой среде, имитирующей, по мнению авторов [86, 2091, предбнологические условия на Земле. Этот син­ тез был проведен в отсутствие воды с применением в качестве ка­ тализатора метафосфорпого эфира.

Нами также сделана попытка синтезировать нуклеиновые кис­ лоты в модельной системе в абиогенных условиях без применения ферментов. Наши условия отличаются от условий, избранных в цитированной выше работе ТПрамма и сотрудников, тем, что син­ тез проводится в водном растворе, в мягких условиях с примене­ нием простых и распространенных веществ, которые, без сомне­ ния, присутствовали на Земле в предбиологический период ее существования.

В качестве исходного материала для этих синтезов были исполь­ зованы гидролизаты нуклеиновых кислот. Гидролиз дрожжевой нуклеиновой кислоты (венгерской марки Реанал) был проведен в 0,3 и. NaOH (50 мл на 1 г кислоты) в течение 18 час. при 37°. Гпдролизат был нейтрализован 0,3 п. НС1.

В этих условиях щелочного гидролиза рибонуклеиновая кис­ лота распадается до рибопуклеотидов [2081.

Опытная полная инкубационная смесь содержала нейтральный гпдролизат РНК — 2,5—5 мл, АТФ — 1—10 мг, восстановленный глютатион — 1—10 мг. Ипкубация при 37° продолжалась от 2 до 48 час.

86

ньш объемом этанола, осадки переосаждали дважды этанолом, промывали 1—2% НСЮ4 при охлаждении для удаления пуклеотидов и подвергали длительному диализу против растворителя при 0 - | - 1 0 , после чего снова осаждали спиртом, промывали спиртом и эфиром, сушили. Часть препаратов подвергали очистке иа ко­ лонке с ДЭАЭ-сефадексом [207, 209].

Полученные препараты для выяснения однородности были подвергнуты хроматографии на бумаге последовательно в двух растворителях: бутанол, уксусная ледяная кислота, вода (4 : 1 : 5) или бутанол, этанол, ацетат аммония (4 : 1 : 2) в течение суток

при 260, 280 и 290 нм и его изменения при 60° [208, 210]. Приго­ товленные по известным прописям гидролиза™ препаратов в 0,3 и. NaOH, в 6 н. НС1, в 98%-ной муравьиной кислоте пли в хлор­ ной кислоте хроматографировали иа бумаге в указанных разде­ лительных смесях, определяли содержание оснований, вычисляли коэффициенты специфичности [206—210]. Кроме того, в препаратах определяли содержание рибозы 1148], фосфора по Фиске — Субарроу, азота по Кьельдалю и молекулярный вес [209, 211].

При вычислении содержания пурииовых и пиримндииовых оснований в препаратах были использованы известные расчетные коэффициенты [202].

Исходное количество нуклеотпдов в объеме щелочного гидролпзата РЫК, взятого для опыта, составляло 18 мг. Выход синтези­ рованного продукта, измеряемый по сухому весу очищенного продукта, совпадал с определением содержания РЫК по фосфату или рибозе.

87

опытной смеси в среднем составил 7,55 мг, или 42% от исходи ого количества нуклеотидов (18 мг). В одном из опытов исходный гпдролпзат РЫК содержал 0,5 г пуклеотндоп. В результате ин­ кубации было получено 225 мг очищенного продукта, в 50 мкг ко­ торого содержалось 5,2 мкг фосфора.

Выход синтезированного продукта в зпачптелыюй степени изменялся в зависимости от взятого количества основных ин­ гредиентов инкубационной смеси при одном п том же количестве гпдролизата (18 мг на сухой вес) (табл. 9).

88

п осле нейтрализации и соответствующей обработки были исследо­ ваны хроматографией па бумаге в вышеуказанных растворителях. Пятна нуклеотндов (рис. 10) пли оснований, как и пятна соответ­ ствующих свидетелей, обнаруженные в ультрафиолете, вырезали, элюпровали 0,01 н. ЫС1 в течение 20 час. прпО + 1°, подвергали анализу, как указано выше.

Результаты испытаний трех препаратов представлены в табл.

12.

Из данных следует, что во всех препаратах содержались все че­ тыре, присущие РНК основания. Количественные отношения осно­ ваний в разных препаратах оказались различными. По мо­ лярному соотношению оснований синтезированные препараты

дрожжевой РНК, в препарате № 1 оно сильно отличалось от ис­ ходного.

По составу оснований препарат № 2 был близок к составу рас­ творимой -РНК дрожжей, печени. Другие препараты соответство­

эффектом как при нагревании до температуры «плавления» — 60°, так и после щелочного гидролиза. Как известно, светопоглощение

1 Часть измерений выполнена под руководством докт. мед. наук Р. П. Нарцисова, которому приносим здесь искреннюю благодарность.

90