книги из ГПНТБ / Титаев А.А. Эволюция органических соединений на Земле. От углерода до биополимеров

малой концентрации в элюатах по сравнению с концентрацией свободных аминокислот осуществить их изолирование и очистку

получить сведения о составе этих пептидов. Число электрофо­

и хроматографии на бумаге, а также путем дииитрофенилироваипя.

61

числа аминокислотных остатков в молекуле, получения пептидов при ферментативном переваривании продуктов синтеза трип­ сином.

Процесс синтеза в наших условиях совершается ступенчато: в первые часы инкубации смеси аминокислот образуются олпгопептиды, а затем, с течением времени, они превращаются в высоко­ молекулярные нолипептиды. Молекулярный вес продуктов син­ теза в среднем составлял 57 450—90 ООО.

Адсорбированная на ионообменной смоле РЫК стимулирует синтез пептидов в присутствии АТФ (см. рис. 4). При этом ка­ чественные различия РНК в зависимости от происхождения отражаются иа составе аминоконцевых групп синтезированных продуктов и начальных пептидов при кратковременных экспе­ риментах.

Следует отметить, что N-концевые аминокислоты в некоторых препаратах ПА, где применялась рРНК из печени, оказались идентичными с N - и С-копцевыми группами природного сыво­

исходного состава аминокислот инкубационной смеси, имитирую­ щего тот или другой белок, получены и различные продукты синтеза, соответствующие по своим качественным и количест­ венным показателям имитируемому белку.

Это обстоятельство, если будет подтверждено, откроет воз­ можность осуществления в предложенной системе целенаправ­ ленного синтеза белка.

Внаших экспериментах была использована в качестве адсор­ бента и катализатора ионообменная смола. Проверочные допол­ нительные опыты доказали, что с таким же успехом для синтеза полипептидов из аминокислот может быть использована и белая глина.

Вприродных условиях предбиологического периода иа Земле

в качестве модели абиогенного синтеза белка предложили метод воздействия аденозиимоиофосфата иа 18 аминокислот при обя­ зательном присутствии глутамина, аспарагина, N-формпл-метио- нина и N-ацетилвалина. В этой модели сначала образуется смесь амииоациладепнлатов, которые затем конденсируются иеэпзиматическим путем в карбонатном буфере при 25°. После трехднев­

рех веществ, то получается вещество малого молекулярного веса.

63

5

Вещества с ферментными свойствами

А ы и л а з о п о д о б н о е в е щ е с т в о . Белковые вещества, синтезированные в предбиологический период, могли обладать ферментными свойствами. Нет ничего невероятного в том, что первичные белки могли образовывать комплексы и с металлами (Fe, Zii, Мп), и органическими веществами — предшественниками коферментов, тем более что возможность синтеза таких веществ в тот же период была вполне вероятной и показана в ряде модель­ ных экспериментов (см. стр. 35). Фоксу удалось выявить фосфатазные, адепозиптрифосфатазные и трансаминазиые свойства

кислот, мы закладывали с самого начала в исходную смесь именно

ветствующие коферменты, соли металлов, специфические для фермента, и аденозинтрифосфорную кислоту.

Синтез проводили в условиях гетерогенного катализа с при­

и, наконец, мальтозы. Йодная проба при этом быстро становится отрицательной. Вторая форма амилазы — [3-амилаза, или 1,4- глюкан-мальтогидролаза (3.2.1.2), действует иа те же полисаха­ риды планомерно, последовательно отщепляя от них молекулы дисахарида мальтозы до полного разложения. Йодная реакция при этом сохраняется долго. Нагреванием разрушается преиму­ щественно (3-амилаза, слабой кислотой — а-амилаза. Этими воз­ действиями можно различать и отделять формы одну от другой.

Имеются данные, что (3-амилаза содержит два активных центра с рН 4,3 н 7,1 с карбоксильной] и имидазолыюй (гистидии) груп­ пами. Молекула амилазы по своей структуре представляет со­

Ход эксперимента в его двух модификациях для синтеза амилазы был аналогичен изложенному в разделе IV . Единственное различие состояло в том, что соотношение аминокислот в инку­ бационном растворе соответствовало известному в литературе количественному соотношению их в природном ферменте [109]. Инкубация растворов длилась одни — пять суток при 37°, причем стерильность растворов была полностью обеспечена и сохранялась

видуальные свойства продуктов синтеза, полученных при инкуба­ ции аминокислотных смесей разного состава (каталаза, карбо-

раствор 0,5—2н. NH4 OH. Элюаты со смолы подвергали диализу, сгущали в вакууме (40°) или теплым воздухом. Для очистки продукта синтеза амплазного действия (именуемого далее ПАм) использовали осаждение элюатов со смолы смесью спирта и ацетона (1 : 3), адсорбцию на крахмале (в 40%-иом спирте) с последующим смыванием фосфатным буфером рН 7,2—7,4 или 0,5н. NH4 OH в присутствии СаС12 и CaS04, а затем диализом,

Продукты синтеза подвергали структурному анализу. Опре­ деляли молекулярный вес, аминокислотный состав, N-концевые аминокислоты, аминоазот по вышеуказанным методам (см. раз­ дел 4).

Ферментативную активность ПАм измеряли в 1/15 М фосфат­ ном' буфере рН 7,2 по Смит и Роу [175] и по Хагедорн — Иенсен,

66

В целях синтеза продукта, обладающего амилолитическим1 действием, была использована, как сказано выше, смесь амино­

в точно одинаковых условиях инкубировали с таким же адсор­ бентом различные другие смеси аминокислот, взятые в том же количестве: 1) смесь, соответствующую составу сывороточного альбумина; 2) смесь, соответствующую составу а-амилазы, но! не содержащую аминокислот активного центра (гистидина, серипа, глицина); 3) смесь аминокислот активного центра амилазы (в количестве 10 мг) в таком соотношении, в каком они нахо­ дятся в природном продукте [109].

Фильтраты, фосфатные и аммиачные элюаты со смолы во всех этих экспериментах, после удаления аммиака в строго одинако­ вых количественных условиях, были использованы для опреде­

II р и м е ч а и й е. В фильтратах активность не обнаружена.

Из представленных данных видно, что элюаты смолы обла­ дают амилолитической активностью, в фильтратах же она отсут­ ствует. Наибольшая активность присуща аммиачным элюатам адсорбента, инкубированного в присутствии смеси аминокислот, соответствующей составу амилазы. Активность элюатов резко уменьшается при отсутствии в смеси аминокислот активного цен-

тра амилазы или при инкубации других смесей. Активный про­ дукт синтеза, очевидно, локализуется на частицах адсорбента и лучше элюируется раствором аммиака, чем фосфатным буфе­

•у-фракции. Амилолитическую активность фракций электрофореграмм устанавливали путем инкубации их при 37° в течение 2 час. после пропитывания 0,1%-иым раствором крахмала в фос­ фатном буфере рН 7,2 с последующим высушиванием и окраской йодом. Для характеристики нескольких очнщениых ПАм были определены: удельная амилолитическая активность (УАА), со­

сталлическом виде вследствие недостаточного количественного со­ держания в них белка.

68

При хроматографпческом анализе гидролизатов аминокислот­ ный состав синтезированного препарата оказался в значительной степени сходным но количественному содержанию с составом исходной смеси аминокислот (в %) :

Отличие в содержании аминокислот между исходным раство­ ром и ПАм сказалось главным образом в отношении лейцина, изолейцина, фенилаланииа, глутамииовой кислоты. В шести пре­ паратах ПАм были определены N-концевые аминокислоты по методу Сэиджера:

18Глицин, аланшг, лейцшг

Вприродной амилазе содержатся три полипетидные цепи с N-концевыми аминокислотами — фенилаланином, аланииом и

69

Ниже показано изменение амилолптической удельной активности ПАм в зависимости от рЫ при 37° (опыты проводили в Vis М фосфатном буфере):

условиях полученный продукт синтеза обладал ожидаемым амилолитпческим действием, но с пониженной активностью. По своим свойствам — отношению к нагреванию, к рН — наш препарат стоит ближе к а-, чем к (3-форме амилазы. Путем хроматографии на бумаге в продуктах гпдролиза крахмала под действием на­ шего препарата была обнаружена только мальтоза, глюкоза же отсутствовала. О полном соответствии нашего препарата с при­

довательности ее в копируемом природном ферменте и конструи­ ровалась по закономерностям, указанным Стейиманом [148]. Активность синтезированного амилазоподобного вещества опре­ делялась, вероятно, констелляцией аминокислот активного цен­ тра, которая была близка к структуре активного центра ами­ лазы. Может быть, наш препарат заслуживает названия «преамилаза».

70