книги из ГПНТБ / Тюкавкина Н.А. Хроматография на полиамидных сорбентах в органической химии

Разливание суспензии и разравнивание на пластинках про­ изводят вручную или аппликаторами типа Desaga [321, 494, 511], а также других тппов [270 — 272, 395, 548, 414]. Высу­ шивание пластинок чаще всего производят прп комнатной тем­

623], реже 150 мкм [374]. Для приготовления тонкнх слоев очень важпо отбирать порошок мелкого зернения: 0,1—0,2~мм

[476, 478, 533 - 537, 586, 674, 702, 706, 708, 709, 711, 714, 715] новый способ получения полиамидных слоев путем нанесения на пластинки и последующего высушивания вязкого гомоген­ ного раствора полиамидной смолы в муравьиной кислоте. Хпанг [315] погружал в такой раствор пластинку и получал слоп с двух сторои.

Приготовление полиамидных слоев по Вангу [704]. 20 г полиа­ мидной смолы амилан СМ 1007 пли СМ 1011 растворяют в 100 мл 75%-ной муравьиной кислоты при перемешивании. 15 мл гомо­ генного вязкого раствора гладко намазывают на каждую из 4 пластинок размером 15x15 см. Пластппкп выдерживают на дне камеры из нержавеющей стали, насыщенной парами воды (стенкп камеры выстилают мокрой фильтровальной бумагой), в горизонтальном положении. Испарение мз'равьппой кислоты ведут либо в течение ночи при 25±2° С, а затем 15 мин про­ гревают при 130° С для удаления следов кислоты [700, 701], лпбо медленно испаряют в течение двух суток при 26 или 29°, а затем прогревают 15 мин прп 100° С [704]. Приготовлен­ ные по способу [704] слои более плотные, чем в способе [700,701].

Полученные таким образом гладкие, непористые полиамид­ ные слоп на стеклянных пластинках пригодны к длительному хранению без изменений. Температурные условия испарения муравьиной кислоты оказывают большое влияние на свойства слоя. Более высокая температура делает слой более грубым, и время прохода растворителя укорачивается. В табл. 40 при­ ведено сравнение времен подъема растворителя по полиамид­ ным слоям, полученным нз одной и той же смолы CM 1007S пу­ тем испарения муравьиной кислоты при 26° и 29°С [704].

Для одномерной хроматографии используются оба вида слоев, для двумерной — слои, приготовленные при 26°С. По­ лиамидная смола амилан СМ 1001 для получения слоев по та­ кому способу непригодна [700]. '

Для препаративных целей Ванг [705] получнл более толстые слои путем нанесения на пластинку большого количества раст­ вора полиамида в муравьиной кислоте (30 мл раствора на одну пластинку размером 15 X 15 см). При этом, если обычные слои [700, 701, 704] получались толщиной 0,055 см, то препаратив­ ные слои имели толщину 0,07 и 0,1 см. Но это было пределом, так как более толстые слои уже сильно растрескивались. При препаративном разделении нитроанилинов [705] отношение ве­ щества к сорбенту составляло 1 : 200, т. е. на пластинку раз­ мером 15X15 см со слоем 0,07 см наносили полосу шириной 0,5 см с нагрузкой 15 мг смеси веществ.

Полиамидные слои очень удобны для препаративной хрома­ тографии из-за высокой сорбционной емкости. Хёрхаммер и сотр. [689] показали, что в одну точку слоя толщиной 250 мкм можно нанести 2000 мкг вещества.

Позднее Ванг и сотр. [703, 710, 712] стали применять поли­ амидные слои, нанесенные на устойчивую к растворителям по­ лиэтилентерефталатную пленку.

Приготовление полиамидных слоев на полиэфирной пленке

[703, 710]. 20 г полиамидной смолы амилан СМ 1011 растворяют в смеси 100 г 90%-иой муравьиной кислоты и 13 мл воды при встряхивании. Через несколько часов получают вязкий гомоген­ ный раствор. 50 мл этого раствора выливают в сосуд (30х20х Х 4 см) п погружают туда шершавую (протертую наждачной бу­ магой) полиэтилентерефталатную пленку толщиной 0,188 мм (23x18 см). Обе стороны пленки равномерно покрываются сло­ ем полиамида. Далее пленку вынимают, держат 2 мин над сосу-

дом, давая стечь избытку раствора, и подвешивают ее в камеро (50x45x45 с м ) > насыщенной водой. Выдерживают при 26 + 2° С одип день. После высушивания на воздухе па другой день об­ резают 1см сннззг, 7 см сверху н по 1,5 см с боков, получая ^пло­ щадь 1 5 x 1 5 см. Такпе полиамидные слои пригодны к длитель­ ному храпению.

Слон па полиэфирной пленке много тоньше, чем па стеклян­ ных пластинках. Они быстро просыхают между двумя пробегашї в двумерной хроматографии (5 мин вместо 15 в случае стек­ лянных пластинок). Этот момент ва?кен прп работе со свото- II теплочувствптельными соединениями. Качество разделения на полиамидных слоях, нанесенных на полиэфирную плепку, зна­ чительно лучше, чем нанесенных на стеклянные пластипки. Площадь пятна получается меньшей, пятно компактное, нера­ стянутое. Для разделения ДНФ-аминокпслот достаточно подъ­ ема растворителя па 8 см вместо 10 см на стеклянных пластин­ ках. В количественных целях не трудно элюпровать разделен­ ные вещества, так как пятна для экстракции можно вырезать. Обе стороны пленки не зависят друг от друга. При одномерной хроматографии на двух сторонах пленки размером 15ХІ5 см можно хроматографпровать до 30 образцов.

Некоторые авторы [391, 477] пользуются готовыми поли­ амидными слоями на стеклянных пластнпках (15X15 см), вы­ пускаемыми фирмой Chen-Chin Trading Co.

Многие исследователи предпочитают пользоваться закреп­ ленными слоями полиамида. В качестве связующего вещества часто используют крахмал и крахмальный клейстер [319, 320, 376 - 378, 480, 520, 546, 572, 724]. Например, 12 г полиамидно­ го порошка M N смешивают с 55 мл метанола и 5 мл 10%-ного водного раствора крахмала. Смесь наносят на пластинки и вы­ сушивают [320]. Слой полиамида, связанный крахмалом, очень прочеп и не нарушается при хранении пластинок в стопках. Известпо применение гппса [366, 511, 512, 564, 605], сахарозы [673], желатины [291, 679], мовплита СТ5а [318], субитогена 2N [455, 676], поливишшацетата [318, 319, 677], пластифика­ тора Paris [343], обойного клейстера, изготовленного на основе метилцеллюлозы [606].

, Очень распространено прибавление к полиамидному порош­ ку целлюлозного сорбента для закрепления слоя. Обычно до­ бавляют 10—20% целлюлозы [351—353, 385, 611, 644, 689]. Такое добавление не ухудшает качества разделения. Иногда полиамидный порошок добавляют в небольших количествах (3%) для закрепления целлюлозного слоя [638]. ( itx- •„

Реже используется смешивание полиамидного порошка с дру­ гими сорбентами, например, полиакрилонитрилом [291], кизельгелем [291], кизельгуром [502], силикагелем [315], целитом [312].

Джолиф п Шеллард [495] провели большую эксперименталь­ ную работу по сопоставлению свойств готовых хроматографических листов, изготовленных на основе силикагеля, окиси алюминия, целлюлозы и полиамида. На примере хроматогра­

фирования двух красителей (флуоресцеин и оранж G) они срав­ нили свойства листов полиамид M N , полиамид MN/UV254 и по­

лиамид К М 1 (табл. 41). Для полиамидных листов Eastman Kodak колебания в значениях Rf меньше, чем для листов M N .

Пастуска и соавт. [582] указывают, что полиамидные листы Eastman-Chromagram имеют ограниченную область примене­ ния из-за того, что они неустойчивы к спиртам и, следователь­ но, их нельзя применять со спиртосодержащими системами раст­ ворителей. Хубл [480] также отмечает, что Eastman-Chromag- ram-листы набухают в спиртах, уксусной кислоте, формамиде и пиридине.

Однако Polygram-листы фирмы Macherey-Nagel могут впол­ не использоваться для разделения флавоиопдов в метанолсодержащих системах [582].

Для многих исследований имеет большое значение чувст­ вительность метода. Ниже приводятся данные по сравнению чувствительности метода по отношению к кверцетину на раз­ личных сорбентах.

Техника хроматографирования

Как правило, хроматографированне на полиамидных слоях производят восходящим методом. Размер пластинок ;самый раз­ нообразный (15X20, 2 0 x 2 0 , 6 X 3 0 , 1 6 x 8 см и др.).

Биркофер [291] описал нисходящий способ хроматографии на полиамидном слое. На рис. 19 показана схема соответствую­ щей аппаратуры. Пластинка заключается в две боковые шины. К верхнему краю прикрепляется ванночка с растворителем. Между ванночкой и слоем сорбента помещается ролик из филь­ тровальной бумаги, у которого один конец погружен в раство­ ритель, а другой соприкасается со слоем и таким образом переносит растворитель на пластинку. Все это заключается в закрытый сосуд. Прохождение растворителя занимает 6 часов. Несмотря на большую затрату времени, метод дает выигрыш в разделении веществ с близкими Rf.

Высокоэффективным оказалось использование S-камер, или камер насыщения [395, 689] (рис. 20). Пятна при этом получа­ ются более компактными и четкими.

Рас. 19. Устройство для нисходящего метода

разделения на тонком слое полиамида [291].

Нанесение хроматографируемых образцов производят обыч­ ным способом. Растворы веществ наносят в виде пятен (наибо­ лее распространенный способ) или в виде полос [291, 339, 378, 435, 671, 705].'

Фреймут п Людвиг [375—378, 546] и другие [480] исполь­ зуют клиновидную технику и считают ее эффективной (см. рис. 14). Для нанесения клиньев поМаттиасу [554] изготавли-

вается шаблон с шириной перемычки 4 мм, высотой 15—20 мм. Этим обеспечивается равномерный подъем растворителя. С каж­ дой стороны перемычки остаются полосы шириной по 1 см. Про­ ба наносится капилляром в середину перемычки во всю ее ши­ рину.

В случае разделения близких по строению веществ рекомен­ дуется проводить многократный подъем растворителя по пла­ стинке в одном направленпи [363, 494, 639]. Например, при хроматографироваиии экстракта квебрахо при однократном проходе растворителя на хроматограмме получается 5 феноль­ них пятен, при трехкратном — 9 [639]. Прп этом рекоменду­ ется высоту подъема растворителя повышать постепенно: в пер­ вом случае 5 см, во втором — 10 см и в третьем — 15 см.

Возможно последовательное использование двух различных систем растворителей в одномерной хроматографии в целях лучшего разделения пятен [366, 546]. Например, для хорошего разделения антноксидантов дважды хроматографировали в снетеме метанол—вода (2 : 1) п для отделения т^енг-бутилоксиаии- зола от дп-трстм-бутплокситолуола дополнительно хроматогра­ фировали еще один раз в хлороформе [546].

Большее распространение в тонкослойной хроматографии на полиамиде имеет одномерный процесс. Зачастую это вполне удовлетворяет исследователей и нет особой необходимости в дву­ мерном хроматографироваиии. Но иногда желательное двумер­ ное хроматографпрованпе лимитируется прочностью полнамидных слоев. Необходимо, чтобы слон были закреплены, напри­ мер, добавкой целлюлозы ИЛИ крахмала [349, 352, 423, 488, 677, 689]. Очень удобны для двумерной хроматографии слои, приготовленные по Вангу [700, 701, 704, 715], и готовые поли­ амидные листы [395, 495, 378]. Ванг широко использовал дву­ мерную хроматографию для разделения смеси производных аминокислот [702, 704, 706, 710, 711, 715, 726]. Эггер [349, 352] прп двумерном хроматографироваиии флавоноидов и их глико­ зидов использовал в первом направлении полярную систему вода—этанол—метилэтилкетон—ацетилацетон, а во втором направлении — хлороформ-метанольную смесь.

ЩРегенерирование полиамидных слоев

Полиамидные слои, приготовленные по методу Ваша [700, 701, 704], могут подвергаться регенерации [713, 715]. Для про­ мывания слоев использовали два вида растворов: А — ацетон— 25%-ный водный аммиак ( 9 : 1 , об.) и Б — ацетон — 90%-ная муравьиная кислота (9 : 1, об.), Промывной раствор А пригоден для удаления веществ кислого характера; раствор Б — для основного и нейтрального типов веществ. Пропитывание слоев этими растворами производится путем погружения в них ис-

Значения Rf некоторых веществ после регенерирования полиамидных

слоев [713]

пользованных хроматографнческих пластпиок, лучше сразу после проявления. Время погружения в раствор Б практиче­ ски не лимитировано, пластинки без изменений могут нахо­ диться в нем свыше 3-х дней. Продолжительность погружения в раствор А не должна превышать 6 часов во избежание от­ слаивания полиамида. После пропитывания пластинки несколь­ ко раз промывались метанолом и сушились сначала на воздухе при комнатной температуре, а затем в течение нескольких се­ кунд в токе горячего (=5-70° С) воздуха. Возможно производить регенерирование слоев 10 раз. В табл. 42 показано, что значе­ ния Rf некоторых веществ остаются одинаковыми на много­ кратно использованных пластинках, прпчем время подъема растворителя пе изменяется после регенерации.

Обнаружение пятен веществ на полиамидных хроматограммах

Для обнаружения веществ на полиамидных слоях исполь­ зуются многие из общепринятых способов. Специфичность по­ лиамидных слоев состоит, однако, в том, что они неустойчивы к действию агрессивных реагентов (кнслот, щелочей) [470].

Следовательно, широко используемый способ обнаружения веществ на силикагеле или окиси алюминия за счет деструктив­ ного разложения концентрированной серной кислотой здесь совершенно неприемлем, так как полиамидный слой выдержи­ вает обработку только разбавленной серной кислотой [735]. Поэтому для полиамидных слоев наиболее употребительны мяг­ кие, недеструктивиые методы обнаружения. Их можно разбить иа две группы:

молекулах хромофорные системы и способны абсорбировать в УФ-области в интервале 200—350 им. При облучении пласти­ нок фильтрованным УФ-светом пятна веществ обнаруживаются по их флуоресценции. Этот метод особенно пригоден для обна­ ружения фенольных веществ, аминокислот и их производных.

Обнаружение веществ за счет их абсорбции. В некоторых случаях при изготовлении слоев к сорбенту добавляют флуо­ ресцирующие вещества. При просматривании в УФ-свете на светящейся оспове видны темные пятна [288, 545, 689]. К по­ лиамидному порошку добавляют обычно большее количество светящегося вещества (5—10%), чем, например, к кизельгелю илн окпсп алюминия (2—5%) [545]. Хороший флуоресцентный индикатор должен не растворяться в обычных системах рас­ творителей и не изменять химических свойств веществ.

Другая возможность состоит в добавлении к полиамиду 20% целлюлозного порошка, что заодно служит и для закреп­ ления слоя. Тогда такие вещества, как флавоны [352] илп липохиноны [353], видны в УФ-свете как контрастные темные пятна на синем флуоресцирующем поле.

К. Ванг и I I . Ванг [707] предложили опрыскивание поли­ амидных пластинок раствором флуоресцирующего реагента (например, 0,5%-ньга спиртовым раствором флуоресцеина).

Обнаружение по флуоресценции после обработки реагентами.

Некоторые вещества проявляют свеченпе после обработки пх щелочнымп реагентами. Поэтому часто используется опрыски­ вание хроматограммы растворами аммиака, 20%-ным раство­ ром соды, 3?6-ным раствором КОН, водным раствором этилендиамина. Флавононды обнаруживаются после обработки спир­ товым раствором А1С13.

Вторая группа методов основана иа использовании реак­ ции азосочетания или окислительно-восстановительных про­ цессов.

Образование азокрасок. Обнаружение веществ на хроматограммах по образованию ярких, контрастных красок в реак­ ции азосочетания с диазотированными сульфаниловой кислотой, бензидином или /г-нитроанилином является очень чувствитель­ ным и широко используемым приемом. Этот метод может быть использован для всех веществ, содержащих оксиароматический фрагмент с пространственно-свободным орто- или пара-поло- жением по отношению к гидроксилу.

Цветные окислительно-восстановительные реакции. Многие вещества фенольного характера проявляются в виде желтых пятен на красном фоне после обработки щелочным раствором перманганата калия [270—272]. Нитрат двухвалентной ртути (реактив Миллона) [609] применяют для идентификации фе­ нольных гликозидов. Широко используется реактив Фолина— Дениса [397, 415]_ и железосинеродистый калий для иденти-

фикации фенолов, антиокспдантов, нндолов, эстрогенов и т. д. Редуцирующие сахара обнаруживаются анплннфорсфорным реагентом. Переход фосфорномолибдеповой кислоты в молибденблау используется для обнаружения фенольиых анти­ окспдантов, 17-кортикостероидов, свободной галловой кислоты.

Прочие цветные реакции. Вещества с карбонильными груп­ пами могут быть обнаружены по реакции с 2,4-динитрофеиил- гидразином, алифатические кислоты — по индикаторам бромкрезолпурпуру, метилроту.

Техника обнаружения заключается почти всегда в опрыски­ вании хроматограмм проявляющим раствором. При количест­ венных определениях необходима точная воспроизводимость цветных реакций .и равномерное распределение проявляю­ щего реагента по пластинке. Метод опрыскивания не удовлет­ воряет этим требованиям. Поэтому Хубл [480] при количест­ венном хроматографированпи кортикостеропдов предложил погружать пластинки на, короткое время в проявляющий реа­ гент. Поскольку для обнаружения кортикостеропдов приме­ няется светочувствительный реагент, то степки сосуда закры­ вали плексигласом. Метод погружения приметім только для связанных (например, крахмалом) полиамидных слоев, так как незакрепленный полиамид держится на пластинке непрочно.

Особым методом обнаружения является радиометрический анализ. В клинических анализах мочи очень важно определить альдостерон, присутствующий в чрезвычайно малых коли­ чествах. Добавлением радиоактивного альдостерона уточняют локализацию альдостерона мочи на хроматограмме [423].

Ниже перечислены наиболее употребительные реагенты для обнаружения различных групп соединений. Методики приготовления этих реагентов не указываются, так как они подробно изложены в общедоступном руководстве [233].

Фенолы

1. Реактив Паули (диазотированная сульфаниловая кислота) [366, 380, 494, 520, 533, 605, 611, 689, 698, 700, 701], а также диазотированный бензидин [494, 605].

2.Реактив Фолина—Дениса [359, 397, 415].

3.Реактив Гиббса [321].

4.0,5%-ный раствор /г-диметнламинокоричного альдегида в

смеси этанола и концентрированной НС1 (95 : 5, об.) [321].

5.20%-ный раствор карбоната натрия [701], 0,1 н. водный КОН [383] с последующим просмотром в УФ-свете; 1 н. метанольный раствор NaOH [611].

6.Водный раствор, содержащий равные объемы 1%-ных рас­

творов FeCI3 и железосинеродистого калия [553, 689]. 7. 0,1 н. раствор пермаиганата калия в насыщенном растворе

карбоната натрия [270—272].