книги из ГПНТБ / Тюкавкина Н.А. Хроматография на полиамидных сорбентах в органической химии

ствляется в системах 1 и 8. Но при таком сочетании систем ухудшается деление ДНФ-феиилаланииа и ДНФ-метпоиина. Хроматографированием в системах 1 и 7 этот недостаток может быть исправлен. Следовательно, подбором систем растворителей мож­ но добиться полного разделения ДНФ-аминокислот.

В табл. 34 приведены значения Д( 30 ДНФ-аминокислот в нескольких системах [706].

Ниже приведены примеры некоторых возможных комбина­ ций систем растворителей для двумерной хроматографии ДНФ-

Авторы [702, 704, 706] обращают большое внимание на ка­ чество приготовления полиамидных слоев. Они нашли [710], что более четкое разделение дают тонкие полиамидные слои, нане­ сенные на полпэтилентерефталатную пленку. Однако для пре­ паративных целей нужны более толстые слои, легче получае­ мые на стеклянных пластинках. Исследователи [705] примени­ ли препаративную тонкослойную хроматографию на полиамиде для очистки ДНФ-аминокислот из продуктов дпнптрофенилирования. Этот метод оказался более удобным, чем перекристал­ лизация.

Метод количественного определения аминокислот в виде их ДНФ-производных с использованием полиамидной слоевой хро­ матографии описан Вангом с сотр. [715]. Лип и др. [536] приме­ нили тонкослойную хроматографию на полиамиде для изучения состава аминокислот Angelica acutiloba в виде ДНФ-производ­ ных и установили наличие в экстракте 18 аминокислот.

Для определения N-концевых групп пептидов и белков ус­ пешно используют наряду с динитрофенильными производ­ ными также фенилтиогидантоины аминокислот [346], которые можно разделять и идентифицировать хроматографией на бу­ маге [266] или тонкослойной хроматографией на силикагеле [584, 585]. Ванг и сотр. [711] сообщили о применении полиамид­ ных слоев для разделения фенилтиогидантоинов (табл. 35). Распределение R, очень хорошее, за исключением лейцина и изолейцина.

T a б л н ц а 3»

Значения Rf фепнлтногидаптопнов (ФТГ) аминокислот в различных

системах растворіїтслсіі [711]

Системы растворителей

Вещества

В последнее время более предпочтительно для определения N-концевых аминокислот в пептидах и белках получать суль­ фамидные производные, так называемые дансиламинокислоты, действием диметиламинонафталин-8-сульфонил хлорида. Они хорошо флуоресцируют, довольно стабильны нрп кислотном гидролизе и могут быть определены с большей чувствитель­ ностью, чем дипитрофенпльные производные [406, 422, 585].

Вудс и Ванг [725] показали, что все дапсилпроизводные аминокислот, обычно встречающихся в белках, быстро и четко разделяются тонкослойной хроматографией на полиамидных сло­ ях. При двумерной хроматографии были использованы системы: вода—90%-ная муравьиная кислота (200 : 3) и бензол—ледя­ ная уксусная кислота (9 : 1). Кроме этого, эффективными явля­ ются системы: «-гептан—w-бутанол—ледяная уксусная кисло­ та ( 3 : 3 : 1 ) , хлоргидрни—-пиридин—толуол—0,8 М N H 4 O H ( 3 : 1 , 5 : 5 : 3 ) , хлорбензол—ледяная уксусная кислота (9 : 1).

Патаки и Ванг [586] воспользовались хроматографией дансиламинокислот на полиамидных слоях для количественных определений путем оценки флуоресценции пятен этих соедине­ ний непосредственно на хроматограммах. Гердайн др. [391] использовали дансилирование бычьих каротидных пептидных комплексов. Авторы провели 150 опытов по двумерной тонко­ слойной хроматографии на целлюлозе, силикагеле и полиами-

Значения R / карбобензоксиамннокислот п их эфпров [712]

де, опробовав более 50 систем растворителей. В результате был отобрап хроматографпческнй метод разделения дапсилпропзводных аминокислот на полиамидных слоях как более простои и высокочувствительный. Этот метод позволил на 30% уполпчить число пептидов по сравнению с другими методами (хро­ матография на бумаге, электрофорез). Хроматографированпе дансиламинокислот проводили в первом направлении в системе вода—муравьиная кислота (200 : 2,7) 1 час и после высушива­ ния—во втором направлении в системе ксилеиол—пиридин—ук­ сусная кислота (10 : 1 : 1 ) 2 часа.

Карбобензоксиампнокислоты и пх эфиры применяются в пеп­ тидном синтезе, п требования к их чистоте очень высокие. Иден­ тификацию и проверку чистоты этих производных аминокислот удобно проводить на тонких слоях полиамида. Ванг [712] изу­ чил хроматографическое поведение 18 N-карбобензоксиамино- кислот и их эфирных производных на полиамидных слоях, на­ несенных на полиэфирную пленку (табл. 36).

Во всех приведенных выше работах исследователи исполь­ зовали полиамидный порошок для разделеипя аминокислот в виде их различных производных. Сапира [621] же сообщил

о возможности разделения на полиамиде непосредственно самих ароматических и гетероциклических аминокислот. Ниже при­ ведены Rf некоторых ароматических аминокислот для трех систем растворителей.

Интересно отметить, что введение в триптофан фенольной гидроксильной группы резко повышает его подвижность в водосодержащих системах и снижает — в системе органических раст­ ворителей,

Азот содержащие гетероциклические соединения

Довольно большая группа природных соединений, содержа­ щихся в растительных и животных объектах, представлена азотсодержащими гетероциклическими соединениями, к числу которых принадлежат важнейшие в биогенетическом отноше­ нии нуклеиновые основания, нуклеотпды и нуклеозиды, а так­ же желчные пигменты, бетацианиновые красители и многие метаболитные производные.Естественно, что вопрос о методах их иден­ тификации, разделения и даже выделения приобретает исключи­ тельно важное значение. Поэтому неудивительно, что в последнее

Специальных исследований по изучению механизма сорбцпонных процессов азотсодержащих гетероциклических сое­ динений не проводилось, но многие исследователи отмечают, что сорбция N-гетероциклических соединений происходит за счет образования водородной связи между атомом водорода, находящимся при азоте, с карбонильной группой ампдного звена сорбента [709]. При таком механизме сорбции NH-rpymra рассматривается как аналог фенольной ОН-группы.

Многие N-гетероцпклы содержат азот не в пиррольном, а в пирроленовом состоянии. В этом случае большую роль играет электронодонорно-электроноакцепторное взаимодействие, за­ висящее от степени ненасыщенности атома азота [597]. Однако выявить прямую взаимосвязь между характером сорбции и на­ личием гетероциклического азота и его состоянием бывает до­ вольно затруднительно, так как в более сложных соединениях имеются и другие функциональные группы, которые также могут участвовать в сорбции.

Индольиые производные относятся к одной из наиболее рас­ пространенных групп метаболитов и встречаются в виде до­ вольно стойких соединений, таких как ипдол, скатол, ипдолилуксусные кислоты и др. Эти соединения более доступны и поэ­ тому чаще используются для изучения хроматографического поведения на полиамидных сорбентах.

Ванг, Тунг п Лай [709J, а также Фреймут с сотр. [376] изу­ чили хроматографнческое поведение ряда пидолов в различных системах растворителей.

Эти авторы показали, что вещества пндольпого характера способны хроматрграфпроваться на полиамиде за счет образо­ вания водородной связи между атомом водорода пиррольного азота и амидпой группой полиамида.

Фреймут [376] предложил метод отделения 5-оксниндолпл- уксусноп кислоты от других ппдолпропзводных в экстракте мочи.

Желчные пигменты представляют собой цепь из четырех пиррольных колец, соединенных тремя атомами углерода (1): и могут разделяться на полиамиде.

Сегура [624] провел фракционирование желчных пигментов сывороткп. Полиамид позволил выделить более трех фракций билирубина.

Большое исследование по разделению желчпых пигментов тонкослойной хроматографией на полиамиде проделали Петри­ ка и Ватсон [597]. Иеэтерифпцпрованпые пигменты разделяли в системе метапол—вода (3 : 1) на двусторонних пластинках. В этой системе хорошо разделялись пигменты, образующие гид­ рохлориды (билены, билитриеиы, некоторые билидиены). Би­ лирубин и мезобилирубин оставались иа старте, но легко раз­ делялись в системе метапол—10%-ный аммиак—вода ( 9 : 1 : 2).

В связи с тем, что изучаемые желчные пигменты содержат полярные кислотные группы, можно было полагать, что они играют существенную роль в хроматографпческом разделении. Однако оказалось, что сложные эфиры пигментов с блокирован­ ными карбоксильными группировками часто разделяются луч­ ше. Следовательно, разделение зависит от состояния гетеро­ циклической азотной группировки.

Шелли и др. 36][6 использовали готовые пластинки с поли­ амидным слоем в системе пропанол—0,2 н. аммиак (3 : 1) для обнаружения гистамииа.

Бетацианины, относящиеся к классу полиметиновых краси­

Из этих соедипештй, которые раньше назывались «азотсодер­ жащими антоцианами», до 1964 г. в индивидуальном состоянии был выделен только бетаиидпи [227]. С применением хромато­ графии на полиамиде из пигментов свеклы удалось не только выделить кристаллический бетанин—гликозид бетанидина, но и показать возможность разделения этих пигментов на 5 зон,

видуальных соединения, два из которых идентифицировали как бетанин и бетацпаиин. Элюцию красителей производили 0,15 М водным ацетатом натрия. Авторы также показали, что хроматография на полиамиде дает наилучшие результаты по сравнению с рапее применявшимися методами. Это дало воз­ можность разработать автоматический метод [598], позволяю­ щий сделать анализ смеси бетацпанпнов за 24 часа. В схему ап­ паратуры включены две полиамидные колонки, заполненные смесью (1 : 1) двух тппов полиамидных порошков, различаю­ щихся величиной частиц. Колонки работают при 5° С, элюция ведется 5%-иой водной лимонной кпслотой, затем 10%-ной ли­ монной кислотой и водным раствором метанола с постепенно увеличивающейся концентрацией спирта. С помощью разра­

и обнаружено 44 производных, большинство из которых не бы­ ло описано ранее.

Пиателли и др. [601] выделили из Zampranthus оксикоричные производные бетанина и изобетанина.

Внлер и др. [729] выделили минорный компонент бетанина

вкрасной свекле — пребетанин, оказавшийся б'-сульфополу- эфиром бетанина. Элюцню его с полиамидной колонки произ­ водили 0,1 Н: НС1. Кроме того, проведено исследование ряда производных бетанина с помощью тонкослойной хроматографии

всистемах 0,33 М пирпдиний формнат, 1 н. НС1 пли 0,2 н. этанольный раствор НС1, т. е. в растворителях кислого характера.

Фервейн [681] предложил для идентификации и полуколи­ чественного испытания чистоты N-метилимидазола (II) и N , N ' - диметилимидазолий иоднда ( I I I ) , синтезированных на основе имидазола ( I V ) , использовать хроматографию на полиамидном слое в метилэтилкетоне.

амидного порошка. Соединение I I I имеет ионный характер н проявляет сильную активность к полиамиду, вероятно, за счет ион-дипольного взаимодействия с N-атомом амидиой группы.

становится почти круглым. Соль, вероятно, функционирует как вытеснитель. Соединение I I неспособно образовывать водо­ родные связи или связи ионного характера. Следовательно, пе­ речисленные три имидазольных вещества проявляют различ­ ную активность к полиамиду.

Наряду с пятичленнымп гетероциклическими соединениями хорошо делятся на полиамидных сорбентах и шестичленные ге-

вещества 0,5 мкг, что значительно меньше, чем в случае цел­ люлозных слоев.

Далее Ванг н By [716] разделили на полиамидных слоях 10 иуклеотидов (табл. 39). Кроме того, авторы [716] отметили значительное преимущество использования в разделении иук­ леотидов электрофореза на полиамидных слоях.

Тонкослойная хроматография на полиамиде была успешно применена при анализе гидролпзата рибонуклеиновой кисло­ ты [716] и иуклеочпдной фракции Cobra venum [714].

Алкалоиды

В современной технологии выделения и анализа природных алкалоидов хроматография занимает важное место. В тонко­ слойной хроматографии используются окись алюминия, цел­ люлоза, спликагель [32], а для препаративного выделения пре­ имущественно ионообменные смолы. Ионообмепная хромато­ графия алкалоидов используется не только в лабораторном масштабе, но и в промышленности, например, при производст­ ве морфиновых алкалоидов, эфедрина, анабазина и т. д. [59, 188. 251]. Контроль за составом растительных экстрактов и па различных стадиях производства осуществляется хроматогра­ фией на бумаге и связан с большими затратами времени. В свя­ зи с этим появление работ по хроматографичестсому анализу алкалоидов на полиамиде раскрывает новые возможности в этой области.

Для разделения и очистки феиольпых четвертичпых алка­ лоидов нзохпиолпнового типа до сих пор пользовались пере­ кристаллизацией получаемых из них пнкратов, нодидов и т. д., но получить при этом чистые основания было трудно. Инопе [485] применил для разделения алкалоидов с одинаковым ске­ летом, ио с различным числом н положением феиольпых ОНгрупп, хроматографию на полиамиде. Этот метод может быть использован для выделения фенольиых алкалоидов пзохинолп-

лоидов изохинолинового и бензилизохиполппового типов, ис­ пользуя смеси ^-(-г-)-армепавипа, £-(-|-)-]Ч-метилкоклаурпна, N , О-дпметилкоклаурина, аполобина, азимилобина и смеси магнофлорин иодида, цикланолин иодида, N , О-дпметилкокла- урин иодида и меиисперин иодида и др.

Кнапп с сотр. [501] фракционировал смесь бпс-бензилизо- хинолиновых алкалоидов из корней и корневищ Xanthorhiza simplicissima на полиамидной колонке и отделил элюцией водой примеси четвертичных алкалоидов, которые легко обнаружи-

вались по их флуоресценции. Третичные алкалоиды оксиакан­ тин и обамегин с одной п двумя свободными фенольиыми окси-' группами более прочно удерживались в верхней части колонки и десорбировались метанолом.

Хуанг и соавт. [476] впервые сообщили о разделении семи природных опийных алкалоидов и их производных на полиамид­

Разделение морфиновых алкалоидов на полиамидных слоях приобретает особое значение в токсикологическом анализе. Бай­ дари [288] при анализе лекарственных веществ показал воз* можпость разделения па полиамидных слоях в системе б е н з о л - эфир—уксусная кислота—метанол (120 : 60 : 18 : 1) пурино­ вих осповаипй и алкалоидов: мочевой кислоты, кофеина, тео­ бромина ,теофпллина и их производных—диокситеофиллина, диоксипропилтеофнллииа и 8-хлортеофиллина. Для обнаруже­ ния алкалоидов в полиамидные слои вводятся флуоресцентные добавки, в результате чего пятна четко выделяются на общем фоне в УФ-свете. На основании полученных данных разработан ко­ личественный метод определения стрихнина.

Таким образом, учитывая большое разнообразие химиче­ ской природы алкалоидов, в структуре которых могут быть фенольные, N-гетероциклические фрагменты, карбонильные и другие функциональные группы, можно полагать, что хрома­ тография на полиамиде найдет более широкое развитие в этой области соединений, тем более, что кроме перспектив разделе­ ния полиампдный сорбент внесет и то преимущество, что поз­ волит исключить жесткую кислотно-щелочную обработку ал­ калоидов.

Стероиды и желчные кислоты

Фреймут и сотр. [374, 376, 377] применили тонкослойную хроматографию па полиамиде в химии стероидов. Этот вид хро­ матографии оказался очень продуктивным по сравнению с хро­ матографией на бумаге, применяемой в клинико-химических лабораториях для изучения обмена стероидных веществ.