книги из ГПНТБ / Тюкавкина Н.А. Хроматография на полиамидных сорбентах в органической химии

Сорбционные свойства полиамидного порошка нногда ис­ пользуют в целях очистки (или отделения) песорбируемых или слабо сорбируемых на нем веществ от примесей фенольного характера. Хёрман [431] использовал полиамидпый порошок для освобождения десертного вина от нежелательных примесей фенольного типа (хлорогеновая кислота, катехины, лейкоантоцианины, флавонолы, флавоны). Порцию вина встряхивали 1 час с полиамидным порошком. Таким способом можно осво­ бождать от фенольных примесей фруктовые соки, сидр, белое вино.

Вухерпфенниг и Бретгауер [728] предохраняли белое вино от окисления обработкой его полиамидным порошком. Обра­ ботку производили из расчета 0,2—0,5 г нейлонового порошка па 100 мл вина. Обработанное вино показало мепьшую тенден­ цию к покоричиевеишо при контакте с воздухом. Аналогичная обработка полиамидом яблочного сока [727] из расчета 2 г/л оказывает положительное влияние па стабилизацию сока, его аромат и внешний вид.

В производстве пива полиамидные порошки и водонерастворимые поливинплпирролидоновые смолы нашли широкое при­ менение для стабилизации за счет связывания фенолов, вызы­ вающих образовапие осадков [418—421, 549—551, 680]. Полиа­ мидные порошки и поливинилпирролидоп оказались незаме­ нимыми для подавления ннгибирующего действия полифеиолов в процессе выделения ферментов из растительных объектов [28].

Представленный в настоящей главе обширный эксперимен­ тальный материал дает наглядное представление о больших возможностях использования полиамидных сорбентов. Эти сор­ бенты не только способствуют эффективному хроматографическому разделенпю органических веществ, по и незаменимы при решении многих практических задач.

Г Л А В А 4

МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАБОТЫ С ПОЛИАМИДНЫМИ СОРБЕНТАМИ

1. КОЛОТЮЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Для наполнения колонок используются порошки самых раз­ личных марок промышленного и лабораторного изготовления (см. табл. 2). Известно, что полиамидные порошки обладают высокой сорбциоииой емкостью, могут быть регенерированы после употребления, работа с ними возможна при наличии про­ стых и доступных растворителей.

Подготовка полиамидных порошков для колоночной хроматографии

Размеры частиц порошков, получаемых переосаждением из растворителей в лабораторных условиях, колеблются в широ­ ких пределах — от 0,08 до 0,4 мм, и фракционный состав их по величине частиц самый различный [328, 381, 514, 718]. После ситового фракционирования увлажненной порошковой массы и высушивания гранулята при температуре не выше 50° С получаются пористые сорбенты, которые способны быстро набухать и равномерно располагаться в колонке [86, 87, 193]. Гранулы, высушенные при более высокой температуре, менее пригодны, так как они слабее набухают и обладают меньшей разделяющей способностью [104]. Порошки, полученные при измельчении в шаровых мельницах, обычно более мелкие (0,08— 0,15 мм) [445]. Но жесткое механическое дробление, как было отмечено Берлипым [25], может приводить к разрыву углеродуглеродно й цепи и появлению иизкомолекулярных продуктов.

В зарубежных странах порошки промышленного изготов­ ления по техническим нормам имеют следующие размеры ча­ стиц: 0,2 мм [454], 0,10-0,15 мм [461], 0,10 мм [450], 0,315 мм

[298]и т. д. У нас в стране выпускаются порошки двух видов:

А( 0 , 1 - 0 , 2 мм) и . Б ( 0 , 2 - 0 , 4 мм) [2].

Однако не все промышленные порошки можно применять для колоночной хроматографии без предварительной обработки. Хёрхаммер и Вагнер [445] предлагают даже лучший из них •— ультранол В — переосаждать из соляной кислоты. РекомеН"

дуется переосаждать порошки ыирампд FP, SP [381], дуретап ВК 31 [459] п др. Некоторые же исследователи используют эти порошки без переосаждения. Из промышленных сорбен­ тов только порошки, приготовленные специально для коло­

Кроме отмывания сорбента от ннзкомолекулярных приме­ сей обращается внимание па процесс набухания сорбента (от 1

готовки порошка для хроматографпровапия красителей [528]: 0,5 г полиамидного сорбента заливают 5 мл дистиллированной воды и оставляют набухать на 12—16 ч. Набухший порошок переносят на стеклянный фильтр № 3 и при небольшом вакууме добавляют 10 мл спиртовой щелочи (0,5 г NaOH в і л 70%-ного метанола), а затем промывают 5 мл 2%-иой уксусной кислоты и водой до нейтральной реакции. Высушивают порошок отса­ сыванием.

Как показано в работе Тюкавкинои и соавт. [222], набуха­ ние сорбента перед началом работы колонки положительно сказывается на увеличении сорбционных свойств.

Подготовка и наполнение колонок

Выбор размеров колонок определяется целями работы и варьируется в широких пределах.

В препаративной лабораторной практике используют ко­ лонки с соотношением диаметр—высота 1 : 10—1 : 20 [16, 365, 390, 397, 450, 455, 479], хотя имеются и отклонения — от 1 : 2 [369] до 1 : 30 [446]. Загружают в такие колонки от 3 до 1000 г капронового порошка [397, 685], но чаще 100—200 г [317, 398, 441].

Для аналитических целей Леман [527] предложил микро­ колонку (см. рис. 15), в которую загружают всего около 100 мг сорбента.

В последние годы наметилась тенденция применять высо­ кие колонки (120—150 см и выше) с загрузкой от 1 до 4 кг по­ рошка [ИЗ, 195, 296, 685]. Проверка этих методов в фотохими­ ческих лабораториях ХНИХФИ показывает, что они не всегда оправдывают себя. Более рационально удается разделить ве­ щества последовательно на нескольких небольших колонках (3X30 — 4X40 см).

Сорбент вносят в колонку преимущественно в виде суспен­ зии в воде, спирте, хлороформе п других растворителях. На­ полнение колонки сухим порошком применяется редко [106]. Для равномерного наполнения используют стеклянную ме­

рование столба сорбента происходит при предварительном промывании колонки в течение 24 ч.

Колонку наполняют сорбентом однородного измельчения или послойно — из более крупного (400—3600 мепг) нижний л верхний слои, а среднюю часть — из более мелкого (3600— ІбОООмеш) [718]. Батюк [19] готовил колонку с послойным рас­ положением «кислого» и «основного» сорбента. Иногда приме­ няют смеси полиамидного порошка с целитом (2 : 1) [524], а также ацетилированный полиамид [342].

Нанесение ц разделение хроматографпруемых веществ

Чаще всего смесь веществ, подлежащих разделению, в виде концентрированного раствора смешивается с частью полиамид­ ного сорбента. После высушивания этот сорбент в виде суспен­ зии вносится на верх столба колонки [566, 593]. Но можно вно­ сить концентрированный раствор веществ и непосредственно в колонку [212, 479, 483, 613].

Ней [566] смешивал смесь изомеров халконов и флаванонов с полиамидным порошком в воде. Суспензию фильтровал, про­ мывал водой для удаления неорганических солей и вносил в колонку с последующим разделением элюцией водно-мета- нольной смесью. Драник и др. [55] наносили спиртовый раствор флавоноидов на порошок полиамида, высушивали его на воз­ духе и вносили в колонку.

Сотникова и соавт. [192, 194, 195] разбавляли спиртовые растворы веществ водой или хлороформом в присутствии по­ рошка полиамида до прекращения выделения осадка феноль­ ных соединений, который при этом равномерно распределялся на сорбенте. Сорбент отфильтровывали, вносили в виде суспен­ зии в колонку и начинали элюцию смесью растворителей.

Высушивание порошка с нанесенными фепольными вещест-

вами целесообразнее проводить в вакууме при повысоких тем­ пературах и в атмосфере азота, так как при распределении этих соединении на развитой поверхности сорбента наблю­ дается окнслоние [471, 501, 642].

Соотношение количества вносимой смеси веществ и веса сорбента в случае хроматографии па полиамиде определяется в основном экспериментально и меняется в широких преде­ лах. Давидек [325, 328] и Хёрхаммер с сотр. [445] нашли, что оптимальное соотношение для фенольных (флавоноидных) сое­ динений равно 1 : 30, в других работах успешное разделенно достигается только при соотношениях 1 : 40 [673], 1 : 93 [642] и более [390, 450].

Разделение веществ проводят, как правило, в одни прием на одной колонке [593, 595, 613]. Но часто проводят предвари­ тельное фракционирование, а затем уже хроматографируют более узкие фракции. Например, Фридрих [381] сначала очи­ щал смесь флавопондов от примесей па колонке с крупным по­ рошком (0,2—0,3 мм), а затем разделял полученные фракции на колонке с мелким порошком (0,2 мм п менее).

Скорость элюцип также определяет успех разделения веществ на колонке. Однако этот показатель большей частью пе указывается в работах. Только в некоторых работах Грасмана [397, 398] и Хёрхаммера [483] отмечалось, что элюцию вели со скоростью 20 капель в минуту для воды [444], 30— 40 капель в минуту для 30%-ного метанола [463, 524] и 25 ка­ пель в мипуту для метапола [483].

Подбор элюентов в каждом случае производится экспери­ ментально, хотя в химии флавоноидных соединений стало тра­ диционным начинать элюцию водой с переходом к смесям воды со спиртом с повышением доли последнего. Агликоновые флавоноиды Л5гчше разделяются в хлороформпо-спиртовых смесях [4, 214, 216, 218, 250, 509]. Из других растворителей можно упомянуть пропиловый и изопропиловый спирты, кото­ рые применяли при разделении сложной смеси антибиотиков группы бревицида [673], смесь хлороформа с диметилформамидом при разделении смеси апигенина и лютеолииа [48], смесь метапола с тетрагидрофураном (1:1), использованную для раз­ деления продуктов ферментативного ркислеиия кемпферол-3- глюкозида [542], и др.

Хроматографировапие в колонках проводят в обычных усло­ виях при комнатной температуре, часто защищая сорбент от прямых солнечных лучей. Однако более стабильных резуль­ татов можно добиться при использовании термостатируемых колонок. Они имеют рубашку, куда подается вода при 30° С [284, 285] или 60е С [643]. Пиателли [598] использовал термо­ статированные колонки с автоматической подачей элюента и автоматическим отбором проб.

Регенерирование полиамидного сорбента

Полиамидиый сорбепт благодаря регенерированию может быть использован многократно. Грасман с соавт. [397] отме­ чают, что полиамидиый порошок возможно регенерировать даже тогда, когда он вследствие поглощения большого ко­ личества фенола приобрел вид вязкой массы.

Обычно при регеиерацин порошка, использованного в ко-* лонках, рекомендуется отбросить верхнюю часть столба сор­ бента и далее последовательно элюпровать водой, 5%-иым раст­ вором аммиака и снова водой до нейтральной реакции [432], Но регенерирование можно проводить и после выгрузки по­ рошка из колонки, например, путем следующей обработки [284]: 200 г капронового порошка суспендируют в 100 мл 5%-ного раствора аммиака в течение 15 мин. Суспензию фильт­ руют, промывают водой до нейтральной реакции. Сырой поро­ шок снова суспендируют в 100 мл 0,01 п. НС1 и перемешивают 15 мин. После этого фильтруют и отмывают до нейтральной реакции.

Ипогда для регенерации сорбента применяют водные раст­ воры формамида пли диметплформамида [459].

В заключение можно отметить, что колоночная хромато­

Колоночная хроматография на полиамиде наиболее часто используется в химии природных соединений для разделения сложных смесей веществ, экстрагированных из растительного материала. Поэтому целесообразно рассмотреть некоторые приемы подготовки их к хроматографированию.

Основным принципом такой подготовки является концент­ рирование исследуемых соединений и частичное освобождение от примесей других веществ. Удаление примесей производится осаждением или реэкстракцией сопутствующих веществ. Воз­ можно также фракционирование суммарного экстракта на группы веществ с последующим хроматографированием каж­ дой группы в отдельности. На примере соединений фенольной

природы рассмотрим более подробно подготовку смесей для хро­ матографировапня.

Растительный материал (надземная часть травянистых рас­ тений, листья, цветки, плоды, корпи, древесина или кора) экстрагируется водой для извлечения фенольных гликозидов

флавоноидов [135. 497, 571], ацетоном [214, 218, 294], а также метилэтилкетоном с водой [280] — для извлечения агликонов фенольного характера. Полз^ченные экстракты упаривают в ва­ кууме (иногда в атмосфере азота) до сухого состояния или до концентрированных растворов. Суммарные экстракты под­ вергают очистке от сопутствующих липофпльпых веществ, та­ ких, как хлорофилл, лшгиды н др., промыванием петролейним эфиром, диэтиловым эфиром, хлороформом пли бензолом [135]. Очищенные продукты растворяют или разбавляют дополни­ тельно водой, и этот водный раствор после фильтрации исполь­ зуют для хроматографирования. Это типичный и наиболее простой пример первичной подготовки [106, 613]. В ряде работ [112, 135] водный концентрат подвергают дополнитель­ ной обработке и проводят осаждение водорастворимых приме­ сей (пептиды, полисахариды и др.) путем разбавления водного раствора этанолом, метанолом или ацетоном. Этот метод ока­ зал большую услугу для отделения от водпых растворов сапо­

наряду с нежелательными прпмесямп липофпльиого характера

из эфирного экстракта водного концентрата апигенин, лютеолин, диосметин и скрофулеин. Пащенко и др. [165, 166] из хло­ роформного извлечения, полученного в результате очистки водных растворов флавоноидов, выделил пренильное произ­ водное лютеолина. Известны примеры реэкстракции из водных растворов оксиантрахиноновых и оксинафталиновых производ­ ных бензолом [10, 63, 190]. Хёрхаммер [441] при выделении производных галловой кислоты экстрагировал водные концент­ раты смесью равных частей бензина и эфира и отделил метило­ вый эфир галловой кислоты от ее эфиров с глюкозой.

Часто используемым методом является реэкстракция феноль­ ных соединений полярными растворителями, которые ограни­ ченно смешиваются с водой. Этим приемом, позволяющим не только извлечь вещества из водных растворов, но и произ­ вести их частичное фракционирование, в настоящее время широко пользуются для выделения фенольных гликозидов

[593, 595, 596] и флавоноидных соединений [117, 454, 467] с помощью этилацетата. Для отделения агликонов водные экстракты обрабатывают смесью этилацетата с диэтиловым эфиром, моиозиды извлекают чистым этилацетатом, биозпды —

глпкозиды. Полученные фракции после упаривания готовят к хроматографии на колонке [135, 290, 381, 641].

Более сложный случай предварительного фракционирования приводит Нимз [567—570] в ряде своих работ по выделению ди- и олигомерных продуктов из лигнина, когда смеси фенольпых веществ сначала разделяют и очищают методом противоточного распределения в аппарате Крейга. Обогащенные двумятремя компонентами фракции далее хроматографируют на капроне.

Иногда для предварительного фракционирования суммар­ ного экстракта используют осаждение группы фенольных веществ ацетатом свинца [731]. Также в этих целях часто при­ меняют менее активные адсорбенты (активированный уголь [617], кизельгель [570], целит [628]). й , наконец, может быть использован сам полиамидный порошок. Каган [497] метанольное извлечение из растительного сырья упаривал в вакууме в присутствии полиамидного порошка. Сухой сорбент обраба­ тывал хлороформом и водой, а флавоноидные соединения десорбировал метанолом. Метанольный элюат после концентрирова­ ния вновь подвергался хроматографированию на колонке.

Предварительная обработка суммарных экстрактов явля­ ется необходимым этапом, значительно улучшающим дальнейшее ^хроматографическое выделение отдельных соединений.

2. ХРОМАТОГРАФИЯ НА ТОНКИХ СЛОЯХ ПОЛИАМИДА

Если в первые годы использования полиамидного порошка как сорбента (1955—1960 гг.) в основном развивались методы колоночной хроматографии, то с 1960—1961 гг. начинается активное внедрение приемов и методов тонкослойной хроматогра­ фии. Тонкослойная хроматография на полиамиде является очень прогрессивным способом вследствие своей быстроты, универ­ сальности и широкого варьирования составов систем раствори­ телей. Но, пожалуй, одним из наиболее ценных качеств этого вида сорбента по сравнению с другими, применяемыми для тон­ кого слоя, является возможность полной десорбции хроматографируемых веществ, что делает этот сорбент незаменимым для количественных анализов и препаративных целей.

Основная техника процесса хроматографирования на поли­ амидных слоях совпадает с общепринятой и описанной в ряде

монографий [6, 102, 233, 609]. Однако особенности полимерного сорбента накладывают отпечаток иа некоторые детали про­ цесса, например, иа способ изготовления слоев, обнаружение пятеп н документирование хроматограмм. Поэтому эти вопросы будут рассмотрены подробнее.

Импрегнпрованпе полиамидом бумаги п целлюлозного порошка

Переходным этапом от колоночной хроматографип к топким слоям полиамида служило использование полиамидной поверх­ ности в виде мпкрослоя, нанесенного на бумагу [380, 513, 553, 698, 699].

Импрегнпрованпе бумаги производили протягиванием ее через 0,5%—3%-пый [513] или 5%-иый [698, 699] раствор полпкапролактама в муравьиной кислоте. Протяиутую через раствор бумагу зажимали между двумя другими листами фильтровальной бумаги и сушплп на воздухе. Такие листы импрегнпрованиой бумаги использовали для разделения фено­ лов [513, 553, 698], алифатических кислот и их амидов [699].

Фрпдрпх [708] пмпрегнпровал бумагу в камере, куда вли­ вал гомогенный раствор мпрамида в смеси соляной кислоты и воды. При добавлении дополнительного количества воды происходило осаждение топкого порошка полиамида, который связывался с бумагой, помещенной в эту же камеру.

Мартин п Хазбэнд [553] показали, что при пропитывании бумаги растворами полиамида в муравьиной кислоте с концент­ рацией 1, 3, 5 п 10% бумага после высушивания содержит 4, 7, 10 и 15% полиамида соответственно.

Но приготовление такой полиамидной бумаги представляет трудоемкую и плохо стандартизуемую операцию. Вероятно, поэтому этот вид полиамидной поверхности не нашел широкого применения.

Барк и Грэхэм [270—273, 395] использовали целлюлозные слои, импрегнированные полиамидом. Полиамид нейлон 66 раст­ воряли в 90%-ной муравьиной кислоте, получая раствор 10% - ной концентрации. После стояния в течение нескольких дней раствор центрифугировали для отделения нерастворившихся частичек. Прозрачный полиамидный раствор (11 мл) добавляли к целлюлозному порошку (13,5 г) и хорошо встряхивали. Во время встряхивания порциями добавляли муравьиную кис­ лоту. Получившаяся таким образом гомогенная смесь поли­ амида и целлюлозы (общий объем 85 мл) удобна для приготовле­

ляется полиамидная оболочка. Целлюлоза при этом содержит

10% полиамида. Авторы [2701 высказали мнение, что как раз такая микротоикая полиамидная поверхность более активна, чем чистый полиамидный слой. Такими же слоями пользовался в своей работе Тадема [6441. Однако в более поздпей работе Грэхэм [395] показал, что Сорбцпоиные свойства полиамидных слоев, нанесенных на целлюлозный порошок, слабее, чем сорбционные свойства готовых полиамидных листов. Целлюлоза, присутствующая в слое, действует как разбавитель. Более универсальными все-таки являются слои из чистого полиамида.

Приготовление полиамидных слоев

Полиамидный порошок может давать незакрепленные и закрепленные слон. Незакрепленный слой получается либо непосредственным напылением (насыпаиием) порошка на стек­ лянную пластпнку и разравниванием его валиком или пластин­ кой с регулированием толщины слоя до 1,0 мм [123, 214—216, 218, 219, 250, 327, 329—331, 339], либо разливанием на пла­ стинки и последующим высушиванием суспензии полиамида в органических растворителях. Первый способ неудобен тем, что слой получается сыпучим и пластинки нельзя наклонять па угол, больший 45° [459]. По второму способу слой получа­

5г порошка Woelm в смеси 32 мл метанола, 15 мл хлороформа, 3 мл муравьиной кислоты [504]

4)в этилацетате