книги из ГПНТБ / Тюкавкина Н.А. Хроматография на полиамидных сорбентах в органической химии

всистеме метанол—вода

Борпес [301] разделял на полиамидных слоях коричную, фенплпропиоиовую, бензойную, 4-феиплмасляиую кислоты в виде их анилпдов в системе толуол—метанол (10 : 2,5).

Много работ посвящено применению полиамидного порош­ ка для выделения и идентификации галловой кислоты и ее эфиров. Галловая кислота и ее производные очень распространены в природе, тем более, что они непременно входят в состав ду­ бильных экстрактов. Хёрхаммер и соавт. [441] выделили мети­ ловый эфир галловой кислоты из метанолыюго экстракта ли­ стьев CoUnus coggygria Scop, колоночной хроматографией на полиамиде элюцией водой. Таким способом метиловый эфир галловой кислоты был отделен от трех флавоновых веществ, присутствующих в этом экстракте и вымываемых с колонки только водно-метанольпыми смесями.

При исследовании фенольных соединений Quercus stenophylla Makino Иосиакава и др. [294] и Камано и др. [498] выделили галловую, эллаговую и 3,3'-диметилэллаговую кислоты из эфирной фракции водного экстракта, а из маточников получен 6-глюкогаллин. Эллаговая кислота и дигаллоилглюкоза най­

Фридрих и Хёле [382] применили тонкослойную хромато­ графию на полиамиде для изучения состава гидролизуемых дубильных веществ и показали наличие пентагаллоилглюкозы. Стадлер и Эндрес [639] методом тонкослойной хроматографии на полиамиде проанализировали различные торговые дубиль­ ные экстракты на содержание фенольных веществ и предложи­ ли ряд подходящих систем растворителей.

Значения Rf галловой кислоты и ее эфиров на полиамидных слоях

[331]

Дубильные экстракты очень удобно разделять на готовых полиамидных листах. Пастуска [581] разделял дубильные эк­ стракты из различного растительного материала (древесины дуба, каштана, коры мимозы, квебрахо, сумаха и т. д.) на хроматографических листах в системе ацетон—вода—пиридин (100 : 20 : 5).

Поскольку производные галловой кислоты используются как антиокислители пищевых продуктов, то имеется ряд работ [318, 319, 331, 375] по анализу этих антпоксидантов. Давидек [331] изучил хроматографическое поведение эфиров галловой кислоты на полиамидных слоях в различных системах раство­ рителей (табл. 31). В работах Коппуса-Пиеребума [318, 319] показано, что в системе метанол—ацетон—вода (6: 2 : 2) значе­ ния Rf галлатов уменьшаются с увеличением длины углеродной цепочки этерифпцирующего радикала, а в системе петролей­ ний эфир—бензол—уксусная кислота (10 : 10 : 5) — увеличи­ ваются. По данным Давидека [331], значения Rf эфиров гал­ ловой кислоты в органических растворителях повышаются с уве­ личением длины этерифицирующего радикала. Следовательно, и для ароматических оксикислот отчетливо выявляется распре­ делительный механизм разделения на полиамиде.

Галловая кислота в свободном состоянии и в виде эфиров с глюкозой (глюкогаллин) и катехинами обнаружена тонкослой­ ной хроматографией в системе метанол—вода—диоксан— мура­

ния галловой кислоты в процессе прорастания семян ревеня, а также продуктов ферментативного расщепления катехингал-

латов. Сотникова, Чаговец п Литвиненко [192] выделили гал­ ловую кислоту из молочая болотного.

Урной [677] сообщил о разделении фепольпых кислот (ва­ нилиновой, сиреневой, феруловой, n-оксибензойиой и др.), вы­ деленных этанолом из ячменного экстракта. Тонкослойную хроматографию на полиамиде проводили двумерно: в первом направлении — в системе этилацетат—уксусная кислота (19 : 1) н во втором — в системе уксусная кислота—вода (3 : 7).

Хнллер [433] при хроматографироваппп хлорогеповой, ко­ фейной, о-кумаровой, к-оксибензойноії, вератровой н многих других кислот отметил ценное качество полиамида в разделении изомеров феруловой кислоты.

Компссарепко, Макаревич, Колесников [90] изучили полифенольпые соединения, сопутствующие дубильным веществам' в скумпии. Листья скумпии экстрагировали 50%-иым спиртом, экстракт упаривали и очищали хлороформом. Полученный ос­ таток хроматографнровалп на полиамидном сорбенте, элюируя водой галлотапшш, метиловый эфпр галловой кислоты и гал­ ловую кислоту.

Бекман и Волькмаи [279] хроматографией на полнаагиде вы­ делили из спиртового экстракта семян и листьев красного бука синаповую, кофейную и хлорогеновую кислоты. Изба и Героут [493] пз корней папоротника выделили колоночной хроматогра­ фией на полиамиде глюкокофейнуго кислоту.

Дранпк [54, 56, 58] провел большое исследование по раз­ работке методов выделения производных кофейной кислоты из свежих листьев артпшока. Прп этом ему удалось разделить сложную смесь из хлорогеновой, неохлорогеновой, 4-кофепл- хинной, 1-кофеилхинной, 1,4-диоксифеиилхниной (цинарии) и изохлорогеновых кислот. Было показано,что цинарин в сырье на­ ходится в виде смеси равных количеств калиевых и натрие­ вых солей.

Хроматография на полиамиде была использована для раз­ деления коричных кислот Zea majus L . [101]. Биркофер с сотр.

ферулоил- и кофеилглюкозиды) на закрепленном желатиной тонком слое полиамида, смешанного с кпзельгелем. Интересно отметить, что на стартовую линию тонкого слоя наносили сус­ пензию анализируемой пыльцы Petunia hybrida в 1,5%-ном водном растворе крахмала и далее хроматографировали в сис­ теме н-амиловый спирт—w-бутанол—этилацетат—уксусная кис­ лота—вода (60 : 20 : 30 : 10 : 5).

Производные кофейной кислоты выделены из листьев папо­ ротника-орляка элгоцией полиамидной колонки смесью этил- формиат—муравьиная кислота (100 : 5) [283]; из надземной ча­ сти Onopordon acanthium L . элюцией диметилформамидом после

Элгоентыая система полиэтплепглнколь — формамцд — му­

Они могут элюпроваться только сильнополярными раствори­ телями, такими как формамцд, диметплформамид, пиридин. Четкие фракции получаются при элюцпи смесью диметилформамида, уксусной кислоты, воды и этанола.

Прочность связывания с полиамидом возрастает с увеличе­ нием числа нптрогрупп в молекуле [359], например, нитробен­ зол < 1,3-динитробеизол <^ сішлі-тринитробензол [359,362, 402].

Электронодонорные заместители, вводимые в нитрованное бензольное ядро, во многих случаях понижают сродство к по­ лиамиду. Исключение составляют такие случаи, когда вводи­ мый электронодонорный заместитель некоплапарен к аромати­ ческому кольцу (например, 2,4-дпшітро-ІЧ,]Ч-диметиланилнн) [373, 436] пли когда он сам способен к образованию водородных связей с полиамидом и, следовательно, вносит дополнительный вклад в активность соединения к полиамиду (например, 2,4-дп- нитроанилпн, 2,4-дииптрофенол). Действительно, если амино­ группу частично или полностью блокировать, как это видно на примере 2,4-динитро-№-метиланилина и 2,4-дннитроацетанилп- да, то аминогруппа уже не участвует в связывании с полиами­ дом [436]. Поэтому значения Rf вышеназванных соединений значительно выше (0,69 и 0,60 соответственно), чем у 2,4-дини- троанилина (0,38).

Тонкослойная хроматография ароматических нитросоединений развивалась несколько позднее [395, 486, 703, 705].'Ванг [705] показал, что в системе СС14— ледяная уксусная кислота ( 9 : 1 ) на тонком слое полиамида значения Rf о-нитроанилина, лі-нитроанилина и ?г-нитроанилина соответственно равны 0,57; 0,35 и 0,16. Вещества эти легко обнаруживаются по их желтой окраске. С выходом выше 90% они элюируются с полиамидного слоя этанолом, и, следовательно, метод может быть рекомендо­ ван для препаративных целей — разделения и очистки, а так­ же количественного определения. Далее Ванг [703] проверил

тонкослойное разделение двадцати нитросоединений в систе­ мах СС14— уксусная кислота (9 : 1), этанол—вода (1 :1), 90%-ная муравьиная кислота—вода (1 : 4), гексан—уксусная кисло­ та (4 : 1), ацетон—вода (1 : 1) и нашел метод удовлетворитель­ ным.

Грэхэм [273, 395] изучил поведение 43 замещенных нитрофенолов на полиамидных слоях различного приготовления, а именно: на слое полиамид—целлюлоза и на полиамидных ли­ стах, приготовленных по методу Ванга и фирмой Macherey— Nagel. В качестве элюентных систем были выбраны 10%-ная уксусная кислота и циклогексан—ледяная уксусная кислота (93 : 7). Результаты, полученные при хроматографированпи нитрофеиолов в этих работах [395, 273], подробно обсуждены в гл. 2.3.

Аминокислоты и пептиды

В настоящее время в исследовании белков, пептидов и ами­ нокислот хроматография занимает одно из важных мест [179]. При решении многочисленных научных и практических задач исследователи чаще всего сталкиваются с необходимостью хроматографироваиия аминокислот и пептидов в виде их произ­ водных.

Высокое сродство нитросоединений к полиамиду позво­ лило широко развить хроматографию специфического класса соединений — динптрофениламинокислот (ДНФ-аминокислот). Реакция динитрофенилирования пептидов и белков с после­ дующим кислым гидролизом широко используется для установ­ ления N-концевых аминокислот. Идентификацию ДНФ-амино­ кислот производят различными способами, включая хромато­ графию па бумаге [295, 563], иа стеклянной бумаге, импрегнированной силикагелем [336], на слоях кизельгеля, целлюлозы, окиси алюминия [426, 458, 585], на колонках с силикагелем, кизельгуром, кремневой кислотой на целите, силикагелем на целите [426], а также электрофорезом [562] и газовой хромато­ графией [324, 602].

Высокоэффективным сорбентом для разделения ДНФ-ами­ нокислот оказался полиамидный порошок. Он был применен для решения конкретных практических задач, а именно: для установления состава белковых макромолекул различных ви­ дов шерсти [284, 285, 432, 643, 732]. Почти одновременно были проведены исследования по выяснению закономерностей раз­ деления ДНФ-производных различных аминокислот [359, 362 , 402].

Цан и Хилле [732] провели динитрофенилирование шерсти, а затем эфирный экстракт гндролизата динитрофенилированной шерсти хроматографировали иа колонке с нейлоновым по-

ротком. Элюцию проводили лимоннокислым буфером (рН=5,0). Было показано, что концевые группы белка шерсти содержат аспарапгяовую и глутампиовую кислоты.

Далее Штеиерле ]і Хнлле [643], Хплле [432] и позже Байер и Шейк [284, 285] методом колоночной хроматографии на по­ лиамиде разделяли и устанавливали состав белков самых раз­ личных видов шерсти. Эфирорастворимые ДНФ-аминокислоты шерсти Штейерле и Хнлле [643] делили с помощью фосфатного буфера (рН=6,8) с термостатированпем полиамидной колонки при 60° С и скоростью истечения 3 мл/ч для быстро движущихся ДНФ-производпых аспарагиновой, глутамиповоп кислот, сорина и треонииа и со скоростью 5 мл/ч для медленно движущихся ДНФ-пронзводиых глутамиповой кислоты, алаиина и валима. Байер и Шенк [285] при разделении эфирорастворимых ДНФамнпокнелот многих видов и сортов шерсти также в качестве элюеита использовали фосфатпый буфер (рН=8,0) при 60° С со скоростью истечения 30 мл/ч и обнаружили аспарапшовую, глутампиовую кислоты, серии, треонин, глицин, алании и валпн.

Разделение эфнронерастворимых ДНФ-амшюкислот (О-ДНФ-

дорастворимые ДНФ-амниокпслоты хроматографировали с цит­ ратпым буфером (рН=3,0) в термостатпрусмоп при 30 °С колонке

Обе группы вышеупомянутых авторов пользовались в своей работе полиамидным порошком, получаемым переосажден ней волокна из раствора в смеси уксусной и муравьиной кислот (20 : 1). При этом Байер и Шенк [284] отмечают, что опробован­ ные ими торговые порошки не давали хорошего разделения. Воспроизводимые результаты получались только на сорбенте, приготовленном по описанному методу [284, 643].

Хёрман, Портатігус [437] и Грасман, Хёрман, Портатиус [402] использовали для элюции ДНФ-аминокислот с полиамид­ ной колонні смеси сильиополярных органических растворите­ лей в отличле от применяемых ранее водных буферов. ДНФ-Ами- кокислоты очень прочно удерживаются на полиамиде и мо­ гут быть десорбированы с него диметилформамидом или пири­ дином в виде широких размытых зон. С помощью системы раст­ ворителей диметилформамид—уксусная кислота—вода—этанол (5 : 10 : 30 : 20) удалось элюировать ДНФ-аминокислоты в ви­ де узких зон [402, 437].

Системы растворителей для ДНФ-амннокислот на полиамидных слоях [704]

Грасмап п Штраух [403] пепользовалп колоночную хрома­ тографию на полиамиде для разделения ферментов и протеинов.

Вапг и сотр. [702, 704, 706] успешно использовали в химии ДНФ-амииокислот тонкослойную хроматографию па полиами­ де. Полиамидный слой дает менее размытые пятпа и лучшее разделение, чем тонкий слой силикагеля [303, -338, 583, 697]. Было опробовано большое число систем растворителей, составы которых приведены в табл. 33. Системы растворителей можно сгруппировать следующим образом: А — органические раст­ ворители с .добавлением уксусной кислоты, Б — водосодержащие системы и В — смешанные.

Система растворителей 9 (табл. 33) такая же, как и исполь­ зуемая в колоночной хроматографии [402, 437]. Она дала впол­ не удовлетворительные результаты и в тонкослойной хрома­ тографии на полиамиде. Растворители 1—9 содержат 10—20% уксусной или муравьиной кислоты. Более высокая концентра­ ция кислоты дает круглые пятпа, уничтожает «хвосты», улуч-

Значеипяі?/ ДНФ-амииокнелот на полиамидных слоях [706]

* Нумерация систем соответствует табл. 33.

шает распределение R/, но в то же время снижает скорость подъ­ ема фронта растворителей. Замена уксусной кислоты на суль_ фаминовую (система 10) не приводит к изменению порядка Rf по сравнению с системой 9. Использование системы пиридин— бензол не привело к хорошим результатам. В системе 8 была преодолена известная трудность отделения двух структурноблизких соединений — ДНФ-лейцина и ДНФ-изолейдпна. Все другие системы эти соединения не разделяют.

Лучшее распределение на хроматограмме дает комбинация систем 7 и 8 — в этом случае удовлетворительно разделяются обычно трудноразделяемые пятна ДНФ-валина, ДНФ-лейцина и ДНФ-изолейцина. Однако пятна бис-ДНФ-лизина и бис- ДНФ-тирозииа перекрываются. Их разделение хорошо осуще-