книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

достоверности физической модели, использованной при выводе формулы. Если бы дело обстояло именно таким образом, то следовало бы признать истинными все физические модели, соз­ данные для математического анализа эффекта молекулярных сит. Однако это было бы нелепостью, поскольку большинство моделей несовместимы и не могут быть совмещены посредством какой-либо трансформации. В таком случае возникает вопрос: какая из предложенных моделей верна, или же их все следует отбросить? *

Поскольку ответить на эти вопросы в настоящее время не представляется возможным, автор придерживается последней концепции, основанной на термодинамическом анализе процесса [33]. Большим достоинством этой точки зрения является то об­ стоятельство, что она не нуждается в каких-либо предположе­ ниях относительно механизма разделения на молекулярных ситах.

5.5.ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ МОЛЕКУЛ - МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНЫХ СИТ

Из материала, рассмотренного в предыдущем разделе, ста­ новится очевидным, что хроматография на молекулярных ситах обладает тем преимуществом, что позволяет оценивать размеры молекул исследуемых веществ; причем для этого вовсе не обя­ зательно иметь тщательно очищенные образцы. Единственное требование состоит в том, чтобы имелась возможность специфи­ ческого анализа вещества в элюате, например с помощью ферментативной реакции. Однако необходимо отметить, что по­ лученные таким путем величины следует рассматривать как ориентировочные. В некоторых случаях расхождение между фактическим молекулярным весом и рассчитанной величиной слишком велико, особенно если неизвестна форма молекул (большинство формул, приведенных в предыдущем разделе, применимы лишь в случае глобулярных макромолекул). Напри­ мер, полиэтиленгликоль (молекула которого линейна) с молеку­ лярным весом 15000 мигрирует на сефадексе G-100 примерно со свободным объемом [36], что в случае глобулярного белка соот­ ветствует молекулярному весу около 100 000.

Существует множество точек зрения относительно того, ка­ кую форму зависимости между Kd и величиной молекул следует

* Дело в том, что не существует экспериментальных доказательств основ­ ного положения большинства выдвинутых концепций — того факта, что мо­ лекулы действительно проникают в гранулы геля. Вполне возможно, что разделение идет на поверхности гранул, хотя это предположение также не подтверждено экспериментально [45].

5.6.1.Высота колонки

Из уравнения (17) очевидно, что относительно большое уве­ личение высоты колонки влечет за собой незначительное воз­ растание разрешения. Так, если высота колонки изменяется от

1 до 2 м, разрешение возрастает лишь в | / 2 = 1,4.

5.6.2.Влияние факторов Rи AR

Сувеличением R первый и третий члены под корнем квадрат­ ным в уравнении (17) также возрастают. Взяв производную,

а) При всех значениях R вплоть до 0,75 вторым членом можно пренебречь по сравнению с первым и третьим. В таком случае им можно пренебречь и при R > 0,75. Соответственно в этом

Поскольку трудно указать точные значения параметров fa и со,-, третий член под квадратным корнем в уравнении (17) мож­ но оценить лишь очень приближенно. Такая оценка наряду с анализом первого слагаемого свидетельствует, однако, о том, что при фракционировании белков второй член будет стано­ виться определяющим лишь в очень редких случаях, а именно когда элюирование ведут с очень высокой скоростью, а разде­ ление идет на крупных гранулах сферической формы.

При обсуждении этих закономерностей совершенно не учи­ тывался тот факт, что для двух данных веществ AR связано со специфической природой геля и, следовательно, может варьиро­ вать в зависимости от его состава. Таким образом, AR является функцией R. Поскольку ранее AR считали константой, выводы, полученные при анализе уравнения (17), являются достаточно приближенными и не всегда применимы на практике.

* По мнению Гиддингса, «любое значение R, близкое I, является неже­ лательным» [37]. Однако это неверное утверждение основывается на исполь­ зовании в работе [37] уравнений (7,2—14) и (7,2—24), в которых совершенно не учитывается тот факт, что по мере приближения R к 1 К стремится к 0.

деле указанного диапазона.

Поскольку лишь в редких случаях известно, каким образом меняется AR в зависимости от R, а уравнение (17) является до­ статочно сложным и не точным, им практически не пользуются для расчета значений R, при которых достигают оптимального разрешения. Поэтому в каждом конкретном случае необходимо предпринимать специальное исследование разрешения на гелях

различного состава. Влияние состава геля на разрешение на­ глядно показано на рис. 3, где в качестве исследуемого образца используется сыворотка крови. Если целью эксперимента является достижение наилучшего разделения трех основных зон, то следует использовать 6%-ный гель. С другой стороны, если наибольший интерес представляют компоненты, соответствующие первой зоне, необходимо использовать 5%-ный гель. Отсюда оче­ видно, что даже незначительные изменения в составе геля ока­ зывают сильное влияние на профиль элюирования. И хотя в дан­ ном случае речь шла о полиакриламидном геле, это положение остается верным применительно к гелям декстрана и агарозы. Иногда среди коммерческих гелей трудно найти образец, обес­ печивающий наилучшее разрешение. В таком случае исследо­ ватель бывает вынужден самостоятельно синтезировать подхо­ дящий тип геля. Методики получения сферических гранул поли­ акриламида [39] и агарозы [40—42] описаны достаточно подробно. Гранулы неправильной формы можно приготовить в лаборатории, продавливая полученный гель через металлическую сетку [43].

В проспектах фирм-изготовителей, посвященных гелям, мож­ но найти графики зависимости R (или К) от молекулярного веса, построенные опытным путем. Из них можно определить ДR для двух веществ с известным молекулярным весом. Из уравнения (17) следует, что разрешение является функцией как AR, так и R. Поэтому наилучшее разрешение не обязательно будет получено на том геле, где ДR достигает максимума. Это довольно распространенное заблуждение, которое иногда встре­ чается и в проспектах фирм.

5.6.3.Зависимость разрешения от диаметра частиц геля

Из уравнения (17) следует, что с уменьшением величины dp снижается и высота теоретической тарелки, т. е. чем меньше диаметр частиц, тем выше разрешение (более узкие зоны). Однако на практике нецелесообразно использовать слишком мелкие гранулы, поскольку в этом случае скорость потока па­ дает, а время эксперимента соответственно растет. Кроме того, как следует из уравнения (16), в случае падения скорости потока начинает сказываться отрицательное влияние диффузии (кото­ рой соответствует первый член в правой части уравнения), имею­ щей тенденцию увеличить высоту теоретической тарелки. Что ка­ сается разделения белков, то нет оснований считать, что частицы геля слишком малы, поскольку, как показали многочисленные эксперименты, скорость элюирования является вполне удовле­ творительной. При фракционировании высокомолекулярных бел­ ков иногда предпочтительно использовать вместо декстрана и

полиакриламида сферический гель агарозы. Сферические гра­ нулы прочнее и, следовательно, могут иметь небольшие размеры, что способствует увеличению разрешения и вместе с тем позво­ ляет элюировать с достаточно большими скоростями [40].

5.6.4.Зависимость разрешения от скорости элюирования

Из уравнения (16) следует, что расширение зон вследствие диффузии [которой соответствует первый член в правой части уравнения (16)] уменьшается при увеличении скорости потока. Обратная тенденция наблюдается в отношении расширения зон за счет вихревой диффузии и местных отклонений от равновес­ ного состояния. Поэтому в каждом конкретном случае сущест­ вует лишь одна скорость элюирования, при которой достигается оптимальное разрешение. Из уравнения (16) следует, что в тех случаях, когда первым членом в правой части можно прене­ бречь, целесообразно иметь возможно более низкую скорость элюирования. Можно считать, что для получения удовлетвори­ тельного разрешения скорость элюирования, как правило, дол­ жна составлять 1—3 мл/ч-см2.

5.7.ТЕХНИКА ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ

5.7.1.Выбор типа геля

Внастоящее время фирмы поставляют следующие типы гелей: а) сшитый декстран под торговым названием сефадекс и агароза под торговым названием сефароза, выпускаемые фир­ мой «Pharmacia Fine Chemicals АВ», Упсала (Швеция); б) сши­ тый полиакриламид под торговым названием био-гель Р и ага­

роза под торговым названием био-гель А, выпускаемые фирмой «Bio-Rad Laboratories», Ричмонд, Калифорния (США). Агароза выпускается также в Англии под торговым названием сагавак

(«Seravac Laboratories Ltd», Мейденхед) и в Дании под торго­ вым названием гелароза («Litex», Глоструп). Все указанные ма­ териалы, исключая сагавак, выпускаются в виде сферических гранул.

Свойства гелей приведены в табл. 1. Эти сведения представ­ ляются фирмами-изготовителями, которые выпускают также спе­ циальные проспекты, содержащие подробную информацию о свойствах гелей и практические рекомендации.

Область применения сефадексов и био-гелей Р ограничивает­ ся веществами с молекулярным весом около 500 000. Для фрак­

ционирования более высокомолекулярных соединений рекомен­ дуется использовать гели на основе агарозы (сефарозу, био-гель А, сагавак и геларозу). Следует отметить, что область примене­ ния гелей агарозы лишь частично перекрывается с областью ис­ пользования гелей декстрана и полиакриламида. Как уже ука­ зывалось, гели агарозы, исключая сагавак, выпускаются в виде сферических гранул, поэтому при фракционировании на них должны по­ лучаться более узкие зоны, чем при применении сагавака.

Первые партии полиакриламидно­ го геля уступали по своим свойствам гелям на основе декстрана. Однако после введения разработанного авто­ ром этой главы нового метода поли­ меризации в суспензии био-гели Р характеризуются удовлетворительны­ ми физическими и химическими свой­ ствами. В большинстве случаев при фракционировании на био-геле Р и со­ ответствующем типе сефадекса полу­ чаются сходные результаты.

большое значение имеет качество пористой пластинки, на кото­ рую опирается столбик геля. Закупоривание пластинки части­ цами геля будет служить основной причиной снижения скорости потока. По-видимому, наилучшие результаты дает пластинка из пористого полиэтилена.

При фракционировании окрашенных белков часто можно на­ блюдать, что вначале узкая зона по мере продвижения вниз ста­ новится, как это показано на рис. 4, все более изогнутой [8]. Причиной подобного искажения фронта вещества, кстати сни­ жающего разрешение, является свойство буферного раствора двигаться вблизи стенок с повышенной скоростью. Этот «стеночный» эффект заметно проявляется на колонках из плексигласа, менее выражен на стеклянных колонках и еще меньше на колон­ ках, обработанных метилцеллюлозой [8].

5.7.3.Заполнение колонок

Для заполнения колонки гранулы гидратированного геля в виде разбавленной суспензии помещают в колонку и оставляют оседать. Мелкие частицы предварительно удаляют повторной декантацией Заполнение колонок мягкими сортами геля ведут при пониженном давлении Для этого нижний конец гибкого шланга, которым оканчивается колонка, помещают на 10—30 см ниже уровня жидкости в резервуаре с суспьнзией. Такой спо­ соб позволяет, оказывая незначительное давление на гранулы, создавать необходимую скорость потока. Последующее элюиро­ вание также осуществляется при пониженном давлении. Мягкий гель защищают сверху фильтровальной бумагой или слоем (2 см) более жесткого геля. В противном случае возникает опасность взмучивания слоя при внесении образца.

Для достижения высокого разрешения большее значение имеет равномерное заполнение колонки. Качество столбика геля можно проверить с помощью окрашенного белка. В качестве та­ кого контрольного красителя рекомендуется также синий дек-

стран 2000 выпускаемый фирмой «Pharmacia Fine Chemicals

АВ». Правда, декстран не совсем пригоден для этих целей, по­ скольку иногда он сорбируется в колонке.

В качестве консервантов, препятствующих росту грибков или бактерий, в буферный раствор добавляют бактериостатические агенты, например азид натрия (в количестве 0,02%).

5.7.4.Внесение образца

При элюировании в нисходящем направлении образец вносят путем наслаивания на слой геля: при этом плотность образца должна превышать плотность буферного раствора. Если плот­ ность образца недостаточна, в раствор добавляют сахарозу, хлористый натрий или другие водорастворимые вещества. Во избежание взмучивания верхнего слоя геля кончик шприца (пипетки или полиэтиленовой трубки) должен быть слегка изо­ гнут. Если элюирование ведут снизу вверх, то образец вносят аналогичным образом, предварительно перевернув колонку.

Высокая вязкость образца приводит к искажению потока в районе зоны вещества, вследствие чего фронт принимает зубча­ тые очертания. Во избежание этого концентрация белка в зоне вообще не должна превышать 4%- Более высокая концентрация допускается лишь в том случае, если образец содержит несколь­ ко хорошо разделяющихся компонентов. Так, например, сыво­ ротку крови, в которой концентрация белка составляет 7%, можно вносить в колонку без разведения (см. рис. 3).