Патогенез Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens является фитопатогеном почвы, который генетически трансформирует хозяина, вызывая корончатые галловые опухоли, важную болезнь, которая затрагивает большинство двудольных растений. В природе, эти опухоли обычно формируются на границе воздух-почва, так называемой короне растения. Взаимодействие Agrobacterium–клетка растения – единственный известный природный пример транспорта ДНК между царствами. В этом процессе, ДНК транспортируется из дикого типа Agrobacterium в ядро клетки растения. Экспрессия этой перемещенной ДНК (T-ДНК) имеет результатом неопластический рост (опухоли) на растении-хозяине.

Для трансформации клетки растения требуются три генетических компонента Agrobacterium. Первый компонент – T-ДНК, которая физически транспортируется из бактерии в клетку растения. T-ДНК – дискретный сегмент ДНК, расположенной на 200-kb Ti-плазмиде Agrobacterium; она ограничена двумя 25-bp неполными прямыми повторениями, известными как границы T-ДНК. Второй компонент – 35-kb область вирулентности (vir), также расположенная на Ti плазмиде, которая состоит из семи главных локусов (virA, virB, virC, virD, virE, viG и virH). Белковые продукты этих генов, которые называют белками вирулентности (Vir), отвечают на специфические вещества, секретируемые поврежденным растением, чтобы произвести копию T-ДНК, и опосредуют ее перемещение в клетку хозяина. Третий компонент – набор хромосомных генов вирулентности (chv), расположенных на хромосоме Agrobacterium. Гены chv вовлечены в хемотаксис бактерии и прикрепление к поврежденной клетке растения.

Поскольку элемент T-ДНК определен границами, область кодирования дикого типа T-ДНК может быть заменена любой последовательностью ДНК без какого-либо влияния на ее перемещение из Agrobacterium в растение. Таким образом, Agrobacterium часто используется, чтобы произвести трансгенные растения, экспрессирующие интересующие гены.

Восприятие сигналов поврежденного растения. Поврежденные растения секретируют сок с характерным кислым pH (от 5.0 до 5.8) и высоким содержанием различных фенольных соединений, типа предшественников флавонидов и лигнина. Эти условия специфически стимулируют экспрессию vir генов Agrobacterium. Лучше всего охарактеризованные и самые эффективные индукторы генов vir – моноциклические фенольные вещества типа ацетосирингона (AS). Эти молекулы не обнаружены, или обнаружены на низких уровнях, у неповрежденных растений, но их количество значительно увеличивается в поврежденных клетках растений.

Сигналы растения воспринимаются сенсорной двухкомпонентной системой бактерий, которая состоит из мембранной сенсорной киназы и цитоплазматического регуляторного белка. У Agrobacterium имеется двухкомпонентная система трансдукции сигнала, состоящая из белков вирулентности VirA и VirG. Вместе, эти белковые молекулы чувствуют сигнальные молекулы, секретируемые поврежденными клетками растения, и активируют экспрессию других vir генов, таким образом инициируя процесс транспорта T-ДНК. Сенсорным компонентом является белок VirA, являющийся сенсорной киназой. Сигналы растения активируют VirA, после чего эта киназа автофосфорилируется в остатке His-474, а затем фосфатная группа переносится на остаток аспарагина белка VirG. Белок VirG взаимодействует с так называемым vir-боксом, то есть с консервативной последовательностью из 12 нуклеотидов в регионах промотора индуцибельных vir генов на Ti-плазмиде.

Прикрепление Agrobacterium к клеткам растения-хозяина является предпосылкой для передачи ДНК. Распознавание Agrobacterium–клетка хозяина – процесс из двух шагов. На первом шаге, бактерии свободно связывают с поверхностью клетки хозяина, и на втором связанные бактерии синтезируют нити целлюлозы, которые стабилизируют начальное закрепление, приводя к тесной ассоциации между Agrobacterium и клеткой хозяина.

Показано, что каждая клетка растения связывает конечное число бактерий; поэтому считают, что в связывание вовлечены насыщаемые поверхностные рецепторы растения. У животных белок внеклеточного матрикса витронектин функционирует как рецептор для нескольких бактериальных штаммов. Подобные витронектину молекулы, которые были найдены на поверхности клетки многих видов растений, могут обусловить закрепление Agrobacterium на клетке растения. Витронектин человека, так же как антитела против витронектина, блокируют прикрепление Agrobacterium к культивируемым клеткам растения. Далее, штаммы Agrobacterium, которые являются неспособными связать клетки растения из-за мутаций в их хромосомных локусах chvB, pscA или att, также выявляют уменьшенное прикрепление к витронектину. Потенциально, подобный витронектину белок (PVN) растений может представить один из рецепторов, ответственных за специфическое взаимодействие между Agrobacterium и клетками растения. Интересно, недавние данные указывают, что PVN связаны с витронектином животных только иммунологически и что никакое подобие последовательности аминокислот не существует между этими белками. В дополнение к PVN, другие белки и углеводы поверхности клетки растения, вероятно, могут быть вовлечены во взаимодействие с Agrobacterium. Однако эти молекулы еще не идентифицированы.

Образование переносимой Т-нити

Индукция экспрессии генов vir в конечном счете имеет одним из результатов производство копии T-ДНК, которая является способной к генетическому преобразованию клеток растения. Различные типы Ti-плазмид несут элементы T-ДНК различного состава. Например, T-ДНК в нопалиновой Ti-плазмиде – непрерывный отрезок ~22 kb. Интересно, что T-ДНК как таковая не оказывает никакого влияния на эффективность перемещения. Поэтому неонкогенные («разоруженные») Ti-плазмиды, с большинством внутренних последовательностей T-ДНК, замененных интересующей ДНК, широко используются как векторы для генетической трансформации растений.

Клетки Agrobacterium с индуцированными генами vir производят линейную одноцепочечную копию области T-ДНК, обозначенную как T-цепь. T-цепь обнаруживается приблизительно в одной копии на индуцированную клетку Agrobacterium. Белки VirDl и VirD2 вместе функционируют как эндонуклеаза, которая выполняет сайт - и цепь-специфические разрезы в участке границ T-ДНК. После расщепления, VirD2 ковалентно прикрепляется к 5′ концу T-цепи. Вырезаемая T-цепь удаляется, и результирующий одноцепочечный промежуток восстанавливается, наиболее вероятно обновленным синтезом ДНК.

Есть сильные параллели между метаболизмом T-ДНК и эволюционно родственным процессом бактериальной конъюгации, которая происходит у большинства бактерий, включая Agrobacterium как таковую. Кратко можно сказать, что система вирулентности Agrobacterium, по-видимому, родственна транспортной системе некоторых плазмид. Хотя, конечно, главное функциональное различие состоит в том, что T-цепь направляется не в другую бактерию, а в ядро эукариотической клетки растения-хозяина.

В середине 1990-х годов были получены прямые доказательства, что в клетку растения и в ее ядро перемещается именно одноцепочечная, а не двухцепочечная, ДНК.

Считают, что T-цепь перемещается из бактерии и в клетку растения как комплекс белок–нуклеиновая кислота. Это промежуточное звено транспорта T-ДНК, названное как T-комплекс, состоит, по крайней мере, из трех компонентов, а именно, из самой молекулы ДНК T-цепи, а также связанных с нею белков VirD2 и VirE2, которые защищают T-цепь, формируют ее в передаваемый (тонкой и развернутый) форме и снабжают специфические сигналы нацеливания. Как было сказано, после разрезания ДНК Ti-плазмиды при посредстве белков VirDl и VirD2, которые вместе действуют как эндонуклеаза, одна молекула белка VirD2 ковалентно присоединена к каждой T-цепи. Также ассоциированным с T-цепью является белок VirE2, который имеет свойство связывать одноцепочечную ДНК. Связывание VirE2 с одноцепочечной ДНК in vitro является сильным и кооперативным, что приводит к формированию очень устойчивых развернутых комплексов VirE2-ssDNA, которые являются в значительной степени устойчивыми к внешней нуклеолитической активности. На основании данных электронной микроскопии и кинетики связывания белка VirE2 in vitro предполагается, что нопалин-специфические T-комплексы имеют 3600 nm в длину и 2 nm в ширину. Они содержат ~600 молекул VirE2 и одну молекулы VirD2 и имеют предсказанную молекулярную массу 50 000 kD.

Транспорт Т-комплекса в клетку растения

Очевидно, что межклеточный транспорт ДНК требует прямого прохода между донором и реципиентом. Таким образом, Agrobacterium, как предсказывается, формирует канал, через который T-комплексы перемещаются в цитоплазму клетки растения-хозяина. Молекулярный механизм, которым этот проход формируется и функционирует – все еще биологический черный ящик. Однако кажется вероятным, что канал Agrobacterium-клетка растения кодируется virB локусом.

Оперон virB содержит кодирует девять белков, для которых показано, что они ассоциированы с бактериальными мембранами. Эти белки стабилизируют один другого таким образом, что функция некоторых продуктов генов virB зависит от присутствия других VirB белков. Эти данные предполагают, что координированный синтез белка стабилизирует отдельные VirB полипептиды, возможно позволяя им формировать многобелковую структуру. Подобная стабилизация белка через взаимодействия белок-белок была описана в течение формирования некоторых пилей у грамотрицательных бактерий. Подобно генерации T-цепей, формирование VirB канала, по-видимому, эволюционно связано с бактериальной конъюгацией.

Транспорт Т-ДНК в ядро клетки растения

Поскольку патогенные микроорганизмы часто используют существующие клеточные механизмы хозяина для их собственных потребностей, Agrobacterium вероятно использует эндогенный клеточный путь для транспорта вторгающегося T-комплекса в ядро клетки растения. T-комплекс Agrobacterium был использован как модельная система, чтобы исследовать общий процесс ядерного импорта нуклеиновых кислот в клетках растения. Размер T-комплекса (50 000 kD) предполагает необходимость активных транспортных процессов. Поскольку T-цепь самостоятельно не несет сигналы нацеливания, ядерный импорт T-комплекса наиболее вероятно опосредуется белками VirD2 и VirE2.

Как правило, у эукариот активный ядерный импорт белков требует специфического сигнала ядерной локализации (NLS). Детальные исследования позволили выяснить, что функциональный сигнал ядерной локализации действительно имеется у белка VirD2 который присоединен к 5’ концу T-цепи, и исследования с мутантами показали, что он действительно активен в направлении T-комплекса в ядро клетки хозяина. Однако VirD2 – не единственный посредник ядерного поглощения T-комплекса. Впоследствии была показана ядерная локализация VirE2, главного структурного компонента T-комплекса. У этого белка были идентифицированы два функциональных NLS. Хотя каждый из сигналов ядерной локализации белка VirE2 был независимо активным, максимально эффективный ядерный импорт VirE2 требовал присутствия обоих сигналов.

В Agrobacterium, содержащей нопалиновую Ti-плазмиду, T-цепь связана с одной молекулой VirD2 и 600 молекулами VirE2. Каждая молекула VirE2 несет два NLS, тогда как VirD2 содержит один функциональный NLS. Почему тогда Agrobacterium нуждается в NLS на VirD2 вообще? Было высказано предположение, что белки VirD2 и VirE2 импортируются в ядро клетки растения функционально различными последовательностями нацеливания и что оба сигнала требуются для оптимального ядерного импорта T-комплекса.

У эукариотических организмов, распознавание сигнала ядерной локализации белка происходит через взаимодействие NLS с клеточными рецепторами, обычно принадлежащими к семейству белков кариоферинов. Введенный в клетку животных белок VirD2 быстро оказывался в ядре; таким образом, сигнал ядерной локализации этого белка является функциональным и в клетках растений, и в клетках животных. В отличие от VirD2, веденный в клетки животных VirE2 оставался в цитоплазме; таким образом, сигналы ядерной локализации этого белка не распознаются в системе животных и поэтому являются специфическими для растений. Таким образом, возможно, что клетки растения имеют набор рецепторов NLS, которые отсутствуют в клетках животных.

Ядерный импорт T-комплекса Agrobacterium достигает кульминации при интеграции транспортированной T-цепи в хромосому клетки растения-хозяина. Молекулярные механизмы, которыми это достигается, в значительной степени неизвестны. В отличие от других мобильных элементов ДНК типа транспозонов и ретровирусов, T-ДНК не кодирует никаких ферментов, которые могут обусловить интеграцию. Таким образом, вставка T-ДНК в геном растения должна опосредоваться белками, транспортированными из инфицирующей бактерии и/или факторами клетки хозяина.

В сравнительно недавних исследованиях было установлено, что оба связанных с T-цепью белка, и VirD2 и VirE2, не только направляют Т-ДНК в ядро, но и вовлечены в процесс интеграции. Т-ДНК является одноцепочечной, и вначале предполагалось, что интеграция предшествует синтезу второй цепи, который может выполнятся механизмами репарации ДНК клетки растения после интеграции T-цепи. Однако более поздние исследования особенностей интеграции T-ДНК привели к предложению, что T-цепи конвертируются в двухцепочечную форму перед интеграцией.

Изучение процесса интеграции Т-ДНК в геном растения позволил получить предположительный ответ на вопрос, почему Agrobacterium поражает только двудольные растения. Оказалось, что в основе устойчивости кукурузы и возможно других однодольных растений к заражению Agrobacterium лежит блокирование интеграции T-ДНК.