44 Аллергия

Аллергия является патологической формой иммуногенной реактивности и характеризуется обычно чрезмерными по выраженности реакциями механизмов гуморального и/или клеточного иммунитета, приводящими к нарушению обмена веществ, структуры и функции органов и тканей, жизнедеятельности организма в целом. Синонимом аллергии является гиперчувствительность (гиперчувствительность немедленного и замедленного типа — ГНТ и ГЗТ). Аллергия (от греч. alios — иной, другой; ergon — действие) — термин, который означает иное действие аллергена, так как при повторном введении в отличие от первоначального он может вызывать расстройства жизнедеятельности. Аллергия возникает под влиянием различных по природе факторов, лежит в основе патогенеза большого числа заболеваний (инфекционно-аллергических, аллергических, аутоаллергических) или сопутствует им в качестве аллергических "наслоений", имеет стереотипные проявления, обнаруживаемые при всех формах аллергии. К ним относятся образование комплексов аллерген — антитело, синтез или высвобождение готовых медиаторов аллергии и развитие расстройств структуры и функции клеток, органов и тканей. Поэтому аллергию обычно относят к типовым формам патологии или общепатологическим процессам.

Аллергия отличается от иммунитета, который является физиологической формой иммуногенной реактивности, тем, что при всех ее вариантах аллергические реакции вызывают повреждение тканей (дистрофию и некроз, анафилактический шок, иммунопатологические процессы и т.п.). Аллергия может возникать под влиянием таких факторов, которые не вызывают иммунитет, — физических (охлаждение, лучевая энергия и др.), химических (пыльца растенй, сульфаниламиды, тиамин), биологических (перхоть животных). В формировании аллергии могут принимать участие особые антитела — реагины, относящиеся к классу IgE, которые имеют аффинитет к собственным тканям, фиксируются на мембранах клеток и в норме обнаруживаются в очень низком титре. Иммунитет характеризуется высокой устойчивостью организма к антигенам, аллергия, напротив, — низкой устойчивостью. Вместе с тем значение аллергии для организма и ее связь с иммунитетом нельзя оценивать однозначно. Иммунитет и аллергия могут быть вызваны одним антигеном; например, у морской свинки в зависимости от дозы, кратности и места введения одна и та же нормальная лошадиная сыворотка может вызвать либо иммунитет, либо аллергию, в частности анафилактический шок. Иммунитет и аллергия имеют общий период развития — иммунизацию (сенсибилизацию), в основе которого лежат перестройка деятельности иммунной системы и выработка гуморальных (Ig) или клеточных (Тл) антител. И при иммунитете, и при аллергии может нарастать титр антител одного класса (например, IgG, IgM), вьшолняющих защитную функцию, т.е. способствующих элиминации антигена ("блокирующие" антитела). В ряде случаев после прекращения аллергии и при искусственном снижении титра аллергических антител устойчивость организма к аллергену может повышаться, как это имеет место при иммунитете. Наконец, аллергены включают неспецифические приспособительные процессы, например воспаление, которое направлено на локализацию, уничтожение и элиминацию данных чужеродных агентов. Таким образом, аллергическая реакция становится способом удаления аллергена, сохранения белкового и клеточного гомеостаза и индивидуальности организма, хотя этот способ реализуется с повреждением тканей.

45 риф

Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. В этом случае из исследуемого материала готовят мазок на предметном стекле, как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют метиловым спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда входящим в состав диагностического набора. На поверхность фиксированного мазка наносят меченные ФИТЦ сыворотки или моноклональые антитела (в случае непрямой РИФ, сначала препарат обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем меченными антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе). Поскольку РИФ является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяется от другого промывкой.

Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длинной волны. Это заставляет флюорохром  светиться в заданном диапазоне спектра. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение.

Наибольшее распространение получили наборы, основанные на прямой реакции иммунофлюоресценции (ПИФ), однако имеются тест-системы, использующие реакцию непрямой иммунофлюоресценции.

Если прямая РИФ может использоваться только для обнаружения антигена, то непрямой вариант этой реакции может быть использован как для обнаружения антигена, так и для серодиагностики (например, при болезни Лайма, сифилисе). В этом случае готовят мазки из эталонного штамма возбудителя. Исследуемую сыворотку наносят на мазок. Если в ней присутствуют искомые антитела, то они связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором позволяет удалить несвязавшиеся антитела. Затем препарат обрабатывают меченной сывороткой против иммуноглобулинов человека. В случае положительного результата реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблюдают специфическое свечение эталонной культуры.

Основным недостатком РИФ является ее субъективность. Классическими критериями специфичности этой реакции являются:

характерная морфология, размеры и расположение возбудителя в мазке;

периферический характер свечения объекта;

цвет флюоресценции;

интенсивность флюоресценции.

При исследовании крупных объектов (трихомонады, гарднереллы, клетки пораженные вирусами) эти критерии позволяют получить высокодостоверный результат. В то же время, элементарные тельца  хламидий и микоплазмы имеют размеры, лежащие на пределе разрешающей способности люминесцентного микроскопа. При этом оценка морфологии микроорганизмов затруднена, а свечение теряет периферический характер. Остающихся критериев явно недостаточно для уверенной идентификации наблюдаемого микроорганизма. В связи с вышесказанным, субъективный характер учета реакции предъявляет особые требования к квалификации персонала проводящего исследования.

46 рск

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА, РСК, реакция Борде - Жангу [по имени бактериологов Ж. Борде (J. Bordet) и О. Жангу (О. Gengou), 1901], высокоспецифичная и очень чувствительная серологич. реакция, основанная на свойстве комплекса антиген - антитело фиксировать свободный комплемент.

Комплемент (система комплемента) (от лат.complementum - дополнение), группа глобулярных белков сыворотки крови животных и человека, представляющих собой часть иммунной системы организма. При попадании в организм инфицирующих его бактерий или вирусов, некоторых токсинов или возникновении собственных трансформированных клеток происходит активация комплемента, в результате чего клетки-мишени лизируются (разрушаются), а токсины и вирусы нейтрализуются. Поэтому систему комплементов рассматривают наряду с макрофагами как передовой рубеж иммунной защиты организма.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов и в серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген - антитело. По существу, это две серологические реакции.

Первая система - основная состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплемент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.

связывание комплемент реакция серодиагностика

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т.е. готовый иммунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой (при соответствии в ней антигена и антитела), то во второй системе гемолиза не будет - так как нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее Осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то иммунный комплекс не образуется и комплемент останется свободным. Оставшийся свободным, комплемент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, - результат РСК отрицательный (содержимое пробирок прозрачно - "лаковая кровь").

Компоненты реакции связывания комплемента:

1. Антиген - обычно лизат, экстракт, гаптен; реже взвесь микроорганизмов

2. Антитело - сыворотка больного

3. Комплемент - сыворотка морских свинок

4. Антиген - эритроциты барана Гемолитическая система

5. Антитело - гемолизин к эритроцитам барана

6. Изотонический раствор

Подготовка ингредиентов

1. Сыворотку разводят в 3 раза меньше ее титра. Готовят общее разведение сыворотки для всего опыта, объем которого определяют, умножив объем сыворотки в одной пробирке (например, 0,5 мл) на число пробирок, немного превышающее число их в опыте. Избыток жидкости необходим при приготовлении всех компонентов реакции: часть ее остается на стенках пробирок, колб, пипеток. Объемы разведенного гемолизина и взвеси эритроцитов, приливая сыворотку к эритроцитам, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37°С (сенсибилизируют).

2. Эритроциты барана. Готовят 3% взвесь отмытых эритроцитов барана на все количество пробирок в опыте. Для приготовления гемолитической системы за 30 мин до внесения ее в опыт смешивают равные объемы эритроцитов барана с антителом к ним.

3. Комплемент обычно разводят 1: 10. Перед каждым опытом его обязательно титруют. Титр комплемента - это его наименьшее количество, при добавлении которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1 ч при 37°С.

4. Антиген обычно получают готовым с указанием его титра, т.е. того количества, которое после разведения антигена должно содержаться в 1 мл. Например, при титре 0,4 его разводят в 0,96 мл изотонического раствора. В опыт берут количество антигена, равное половине титра (0,5 мл). Это его рабочая доза. Готовят общее разведение антигена для всего опыта, умножая 0,5 мл на число пробирок в опыте.

5. Антитело - сыворотка больного. Свежую сыворотку перед опытом инактивируют, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56°С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ предпочтительнее: он исключает возможность перегрева

Постановка реакции связывания комплемента (РСК).

Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента).

Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1: 5 и 1: 10 (доза сыворотки 0,04 куб. см и 0,02 куб. см со специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным антигеном (на специфичность) и без антигена (на антикомплементарность).

Испытуемые и контрольные сыворотки инактивируют в день постановки реакции в разведенном виде при 56-65°С (в зависимости от вида животных) в течение 30 мин. (также в РДСК).

Оба этапа реакции проводят в водяной бане при 37-38°С, бактериолитическую систему выдерживают 60 мин, второй этап реакции (с гемолитической системой) - 20 мин.

Контроли главного опыта РСК:

позитивная сыворотка в разведении 1: 5 без антигена и с контрольным антигеном; в разведениях от 1: 5 до ее титра со специфическим антигеном;

негативная сыворотка в разведениях 1: 5 и 1: 10 со специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным антигеном и без антигена - антигены специфический и контрольный в двойной дозе - на антикомплементарность (комплемент +) и на гемотоксичность (комплемент);

гемолитическая система на гемотоксичность (комплемент).

Учет результатов. В контролях не должно быть даже следов гемолиза, так как в одном из них нет комплемента, в другом - гемолизина. Контроли свидетельствуют об отсутствии у компонентов реакции гемотоксичности (способности спонтанно лизировать эритроциты).

В опыте активность комплемента может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплемента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это - рабочая доза.

Существуют различные варианты постановки РСК: классич. метод постановки в виде макро - и микровариантов, реакция длительного связывания комплемента (РДСК) на холоде, метод количеств. РСК по 50 % -ному гемолизу сенсибилизированных эритроцитов и др. Для диагностики ряда заболеваний применяют более чувствительный метод - РДСК.

Постановка реакции длительного связывания комплемента (РДСК).

Первую фазу реакции проводят в холодильнике при 2-6°С в течение 16-18 час., вторую фазу в водяной бане 20 мин при 37-38°С.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1: 25 или 1: 30 (при определении его рабочего разведения).

В первый день разливают сыворотки и антиген для главного опыта. Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента). Контроли РДСК такие же как при постановке РСК.

Затем во все пробирки главного опыта и соответствующих контролей разливают комплемент по 0,2 куб. см в зависимости от его рабочего разведения, пробирки встряхивают и помещают в холодильник на 16-18 час. при 2-6°С.

На следующий день штативы с первой фазой вынимают из холодильника и после выдерживания в течение 20-30 мин. при комнатной температуре во все пробирки разливают гемолитическую систему в дозе (в приведенном примере - 0,6 куб. см). Штативы встряхивают и помещают в водяную баню на 20 мин. при 37-38°С.

Схема главного опыта РДСК представлена в таблице 3.

Учет результатов РСК, РДСК проводят дважды: первый раз - сразу после водяной бани, второй - после оседания эритроцитов на дно пробирки (через 3-4 часа после водяной бани) или на следующий день при хранении в холодильнике от 2° до 6°С.

Для объективного определения результатов реакции оценку рекомендуется проводить в процентах гемолиза. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным (100%) гемолизом и жидкость из них сливают в одну пробирку. Из нее готовят разведения с меньшим процентом гемолиза так называемую "Стандартную " шкалу.

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со степенью гемолиза в "стандартных" пробирках и процент гемолиза выражают в крестах.

Степень задержки обратно пропорциональна проценту гемолиза эритроцитов:

++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная, бесцветная;

+++ (3 креста) - гемолиз 25 % эритроцитов;

++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;

+ (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов;

(минус) - полный гемолиз эритроцитов, осадок отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

Оценка результатов РСК, РДСК.

Оценивают испытуемые сыворотки в разведениях 1: 5 и 1: 10 (0,04 куб. см, 0,02 куб. см) при полном гемолизе эритроцитов в контроле сыворотки без антигена и с контрольным антигеном.

Положительной оценивают реакцию при задержке гемолиза эритроцитов на 3-4 креста в разведении 1: 10.

Сомнительной - при задержке гемолиза эритроцитов на 1 крест в разведении сыворотки 1: 10 и от 2 до 4 крестов в разведении 1: 5.

Отрицательной - при полном гемолизе эритроцитов в разведениях сыворотки 1: 5и 1: 10.