Разностная (дифференциальная ) спектрофотометрия

При работе с биологическими объектами часто бывает необходимым выявлять относительно небольшие изменения в оптической плотности объекта на фоне неизменного и сильного общего поглощения света образцом. Для решения этой задачи широкое распространение получил метод разностной спектрофотометрии.Суть этого метода состоит в том, что на спектрофотометре измеряется не абсолютная оптическая плотность исследуемого образца (D_и), а разность (D_р) между оптической плотностью стандартного образца (D_ст) иD_и. Исследуемый образец получают из стандартного, оказывая на него специфическое модифицирующее воздействие (например, окисляя или восстанавливая определенные хромофорные группы, меняя их заряд и т.д.).

Задание работы

Методом разностной спектрофотометрии показать исчезновение характерной полосы поглощения при 550 нм перманганата калия при его окислении тиосульфитом натрия. Поскольку метод разностной спектрофотометрии (см. выше) не требует регистрации производных, все измерения при выполнении этого задания проводятся только в режиме «D». Для получения разностного спектра необходимо сначала зарегистрировать «нулевую» линию – спектр, отражающий различия в толщинах кювет и концентраций перманганата калия в кюветах с «образцом» и «контролем». Для этого в обе кюветы помещается одинаковый водный раствор перманганата, и производится регистрация спектра поглощения в спектральном диапазоне 460-610 нм. Полученный спектрне должен представлять из себя идеальную прямую – это означает, что прибор не регистрирует различий в оптической плотности, каковые всегда имеются из-за небольших различий в толщине кювет и концентраций растворов у опытного и контрольного объектов. После регистрации «нулевой» линии непосредственно в «контрольную» кювету вводятся 1-2 кристаллика тиосульфита натрия, полностью растворяются в ней, и запись спектра повторяется. При правильном выполнении задания при повторной регистрации спектра на нем появляется ранее отсутствовавшая полоса поглощения при 550 нм. В окончательном виде разностный спектр вычисляется путем вычитания из последнего измеренного спектра «нулевой» линии.