Нерепликативная транспозиция
•Сначала транспозаза сводит вместе концы ПЭ и делает разрывы точно по ним (тупые концы). Образуется основной промежуточный продукт.
•Затем транспозаза сводит в контакт концы элемента и дуплекс ДНК-мишени. При этом она делает в обеих цепях ДНК-мишени ступенчатые разрывы, отстоящие друг от друга на столько п.н., сколько их обнаруживается в прямом повторе ДНК-мишени у данного элемента (обычно 5-9 п.о.)
•Затем происходит рекомбинация 3’- OHконца транспозона с 5’- P- концом
мишени. Для работы транспозазы не требуется затраты энергии.
•Репаративная репликация бреши с образованием прямых повторов ДНКмишени. Требуются энергетические затраты.
•Лигирование
30
Репликативная транспозиция транспозонов
•ПЭ, перемещаясь в другую молекулу, оставляет свою копию в исходной ДНК.
•Начальные этапы обоих механизмов и способ образования повторов ДНК-мишени в сайте внедрения транспозона одинаковы.
•Транспозаза делает однонитевые разрывы в исходной ДНК на обоих 3'-концах транспозона, образуя одновременно в реципиентной ДНК ступенчатый разрез и присоединяет ковалентно свободные 3'-концы транспозона к выступающим 5'-концам разреза.
•"Ступеньки" разреза ДНК-мишени заполняются ДНКполимеразой.
•Образовавшееся соединение (интермедиат) является общим для обоих механизмов транспозиции.
•При репликативной транспозиции однонитевые участки, содержащие транспозон, достраиваются с помощью ДНКполимеразы до двунитевых. При этом интермедиат превращается в коинтеграт, в котором исходная и реципиентная ДНК разделены одинаково ориентированными транспозонами, окруженными повторами ДНК-мишени.
•По области транспозонов происходит разъединение
коинтеграта на две молекулы ДНК с помощью гомологической |
31 |
или сайт-специфической рекомбинации. |
|
Незаконная рекомбинация
•Сборная группа процессов, где рекомбинация происходит без гомологии и механизмов сайт-специфической рекомбинации и транспозиции.
•Общее свойство - соединение разорванных концов негомологичных молекул ДНК:
•захват ретровирусом некотрых клеточных генов;
•интергация фрагментов ДНК, вводимых в клетки позвоночных с помощью микроинъекций;
•поздние этапы перестройки генов Ig (на стадии воссоединения концов разрывов);
•репарация двухцепочечных разрывов у млекопитающих.
•Механизм незаконной рекомбинации - негомологичное соединение концов
(NHEJ - Non-Homologous End Joining).
•Известные ферменты незаконной рекомбинации
–рекомбинация in vitro между плазмидой рBR322 и фагом λ катализируется ДНК-гиразой Е.coli; АТР не требуется. Модель с участием двух молекул ДНК-гиразы (по 4 СЕ), разрывающих и удерживающих вместе две цепи в двух молекулах ДНК;
–у прокариот и эукариот - ДНК-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа, активирующаяся связыванием со свободными концами ДНК независимо
от их происхождения). Участвует в перестройке Ig (воссоединение концов разрывов) и в репарации двухцепочечных разрывов у млекопитающих. Фермент активируется, связываясь со свободными концами ДНК 32
независимо от их происхождения, и соединяет эти концы.
Негомологичное соединение концов NHEJрепарация
•ДНК-зависимая протеинкиназа (DNA-PK) состоит из каталитической СЕ и 2 СЕ Ku.
•Две DNA-PK сближают разорванные концы ДНК. DNAPK фосфорилирует гистоновые белки и SSB (или белок репликации А).
•2 СЕ Ku с хеликазной активностью расплетают концы ДНК.
•Спаривание оснований в короткой области гомологии.
•ДНК-лигаза (при участии белка XRCC4) сшивает нити.
•Мутации в гене DNA-PK приводят к повышенной чувствительности к радиации и к иммунодефициту (нарушается формирование Ig и TCR).
33