attP |
Интеграция бактериофага λ |
|
•Как и все топоизомеразы I, интеграза делает разрыв в одной цепи каждого дуплекса, в месте разрыва образуются 3'-P и 5'-OH-концы ДНК.
•Фермент ковалентно связывается с 3'-P-концом (через Tyr или Ser), благодаря чему энергия разорванной фосфодиэфирной связи сохраняется, и для последующего замыкания разрыва, осуществляемого тем же ферментом, не требуется дополнительной энергии (отличие от ДНК-лигаз, использующих энергию АТФ).
•Образуется "временный" разрыв цепи ДНК (отличие от фиксированных одноцепочечных разрывов эндонуклеазами).
•Образуется комплекс интегразы с attP-сайтом и белком IHF – интрасома - сложная нуклеопротеидная структура, которая захватывает сайт attB.
•Интеграза осуществляет рекомбинацию между att-сайтами путем замыкания фосфодиэфирной связи с 5'-OH-концом из другого дуплекса, то есть путем обменов 5'-OH-концами. Интеграза производит обмен между двумя цепями одинаковой полярности.
•Затем на расстоянии 7 п.н. происходит вторая пара обменов между двумя другими цепями, не участвовавшими в первом обмене. Вторая пара обменов приводит к интеграции фага.
• Предполагается, что для катализа этой реакции необходимы четыре |
5 |
субъединицы интегразы, связанные в att-сайтах (по 1 на цепь ДНК). |
|
Мономеризация ДНК фага Р1 фаговой интегразой Cre
•При репликации фага Р1 образуются кольцевые мультимерные ДНК, которые разрешаются на мономеры путем сайтспецифической рекомбинации по сайтам loxP при участии интегразы фага Сre-белка.
•Бактериофаг Р1 кодирует рекомбиназу Сre (causes of crossing-over), которая катализирует рекомбинации между двумя идентичными последовательностями длиной 34 пары оснований - loxP.
•Рекомбиназа связывается с 13нуклеотидными повторами (указаны на рисунке идущими навстречу друг другу стрелками).
•В середине находится корпоследовательность, не принимающая участия в связывании с рекомбиназой, служащая местом рекомбинации.
•Кор-последовательность асимметрична. Она задает вектор направления двух рекомбинирующих мишеней - они должны быть расположены параллельно друг другу6 в
отношении кор-последовательности.
Модель Cre-ДНК интермедиата
(основана на данных рентгеноструктурного анализа)
• Четыре субъединицы
белка (рекомбиназы) Cre в комплексе с двумя дуплексами ДНК
• Разрыв в одной паре
цепей двух дуплексов:
– 5’-OH концы свободны,
– 3’-P связаны с OH-
группой Tyr белка (показаны стрелкой)
• |
Перевоссоединение в |
|
|
этой паре цепей двух |
|
|
дуплексов |
|
• |
Разрывы и перевос- |
|
|
соединение– в другой |
|
|
паре цепей. |
7 |
Использование Cre-рекомбиназы в генной инженерии
• Синтезируемый бактерией фермент консервативной сайт-специфической
рекомбинации может быть использован для удаления заданных генов из определенных тканей мыши. Для этого требуется встраивание двух специальных ДНК-конструктов в клетки зародышевой линии животного.
• Первая содержит ген рекомбиназы (Cre бактериофага Р1) под контролем
тканеспецифического промотора, что гарантирует экспрессию этой рекомбиназы
только в определенной ткани (печень).
• Вторая содержит
интересующий нас ген, фланкированный участками (loxP), узнаваемыми этой рекомбиназой. Мышь должна содержать только одну копию этого гена. Поэтому, нужный нам ген будет удален только в ткани, где экспрессируется рекомбиназа.
• Используя разные
тканеспецифические промоторы или промоторы, работающие в определенные этапы онтогенеза, можно изучать последствия
делетирования различных
8
генов на разных стадиях развития тканей и органов.