Volume1
.pdf
378 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.4.76.Прослеживаниепредковойпоследовательностиподаннымсравненияпоследовательностей кодирующих областей генов лептина человека и шимпанзе. Лептин — гормон, который регулирует усвоение пищи и использование энергии в ответ на адекватность запасов жира. Как обозначено кодонами, помещенными в зеленые области, только по 5 нуклеотидам (из общего числа 441) отличаются междусобойэтидвепоследовательности.Болеетого,прианализекодируемыхэтиминуклеотидными последовательностями аминокислотных последовательностей оказывается, что последовательности лептиначеловекаишимпанзеотличаютсятольководнойизэтих5позиций.Длякаждойиз5различных нуклеотидныхпозицийобозначенатакжесоответствующаяпоследовательностьугориллы.Вдвухслучаях последовательностьгориллысогласуетсяспоследовательностьючеловека,тогдакаквтрехслучаяхона согласуетсяспоследовательностьюшимпанзе.
Каковажебылапоследовательностьгеналептинаупоследнегообщегопредка?Эволюционнаямодель, котораястремитсяминимизироватьчисломутаций,предположительнопроизошедшихвходеэволюции геновчеловекаишимпанзе,предполагает,чтопоследовательностьлептинапоследнегообщегопредка былатакойже,какпоследовательностиучеловекаишимпанзе,когдаонисогласуются;когдаонинесогласуются,модельиспользуетпоследовательностьгориллывкачествеконечногокритерия.Дляудобства приведенытолькопервые300нуклеотидовкодирующихлептинпоследовательностей.Остальные141 тождественныучеловекаишимпанзе.
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 379
ных обезьян (рис. 4.75). Главнейшим субстратом для построения такого дерева служат данные по сравнению последовательностей белков или генов. Например, сравнения между последовательностями генов или белков человека и таковых у человекообразных обезьян обычно показывают наименьшее число различий между человеком и шимпанзе и наибольшее между человеком и орангутаном.
Для таких близкородственных организмов, как человек и шимпанзе, относительно легко восстановить последовательности генов вымершего последнего общего предка этих двух видов (рис. 4.76). Близкое подобие между генами человека и шимпанзе обусловлено главным образом коротким периодом времени, на котором происходило накопление мутаций в двух расходящихся линиях родословной,
ане функциональными ограничениями, которые поддерживали последовательности
внеизменном виде. Доводы в пользу этого представления основываются на том наблюдении, что даже последовательности ДНК, порядок нуклеотидов которых функционально не ограничен, — такие как последовательности, которые кодируют фибринопептиды (см. разд. 5.1.1), или третья позиция «синонимичных» кодонов (кодонов, определяющих одни и те же аминокислоты, см. рис. 4.76) — являются у человека и шимпанзе почти тождественными.
Для состоящих в гораздо менее близких отношениях организмов, как например, человек и курица (которые эволюционировали по отдельности на протяжении около 300 миллионов лет), консервативность последовательностей, обнаруживаемая
вгенах, связана главным образом с очищающим отбором (purifying selection; то
есть отбором, который изымает из оборота особи, несущие в себе мутации, которые нарушают важные генетические функции), а не с недостаточным периодом времени для возникновения мутаций. В результате кодирующие белок, кодирующие РНК и регуляторные последовательности в ДНК часто оказываются на удивление консервативными. Напротив, основные доли последовательностей ДНК в геномах человека и курицы разошлись из-за множественных мутаций столь далеко, что часто не удается выровнять их друг с другом.
4.5.3. Филогенетические деревья, построенные на основании сравнения последовательностей ДНК, позволяют проследить эволюционные отношения всех живых организмов
Объединение филогенетических деревьев, основанных на сравнениях молекулярных последовательностей, с палеонтологическими данными привело к воссозданию наилучшей из имеющихся картины эволюции современных форм жизни. Данные палеонтологии остаются важным в качестве источника абсолютных дат, основанных на распаде радиоизотопов в горных породах, в которых найдены окаменелости. Однако точное время расхождения видов трудно установить по окаменелостям, даже для видов, в окаменелостях которых четко различима морфология.
Такие объединенные филогенетические деревья предполагают, что изменения в последовательностях специфических генов или белков, как правило, происходят с почти постоянной частотой, хотя в отдельных линиях генеалогического древа жизни наблюдаются скорости, отличающиеся от нормы не менее чем вдвое. Как было упомянуто выше и еще будет сказано в главе 5, такие «молекулярные часы» бегут наиболее быстро и регулярно в последовательностях, которые не подвергаются очищающему отбору, как например, межгенные области, интронные участки, которые не подвергаются вырезанию или действию регуляторных сигналов, а также гены,
380 Часть 2. Основные генетические механизмы
которые были безвозвратно инактивированы мутацией (так называемые псевдогены). Такие часы бегут наиболее медленно в отношении последовательностей, которые подчинены сильным ограничениям со стороны их функции,— например, аминокислотные последовательности белков наподобие актина, которые участвуют в определенных взаимодействиях с большим числом других белков и чья структура поэтому заключена в жесткие конформационные рамки (см., например, рис. 16.18).
Иногда быстрое изменение наблюдается в ранее высококонсервативной последовательности. Как будет обсуждено позже в этой главе, такие эпизоды особенно интересны, потому что они, как думают, отражают периоды интенсивного положительного отбора мутаций, которые дали им преимущество при отборе в определенной последовательности поколений, где такое быстрое изменение произошло.
Молекулярные часы бегут со скоростями, которые определяются и частотой мутаций, и степенью очищающего отбора определенных последовательностей. Поэтому совершенно разная калибровка требуется для тех генов, что реплицируются и восстанавливаются различными системами в клетках. Что наиболее примечательно, у животных, к растениям это не относится, часы, основанные на функционально неограниченных последовательностях митохондриальной ДНК, бегут намного быстрее, чем часы, основанные на функционально неограниченных ядерных последовательностях; очевидно, это связано с необычайно высокой частотой мутаций в митохондриях животных.
Молекулярные часы имеют более точное разрешение по времени, чем летопись окаменелостей, и служат более надежным руководством для воссоздания подробной структуры филогенетических деревьев, чем классические методы построения деревьев, которые опираются на данные сравнительного анализа морфологии и раз-
Рис. 4.77. Филогенетическое дерево, построенное для некоторых млекопитающих, геномы которых интенсивноизучаются.Длинакаждойлиниипропорциональначислу«нейтральныхизменений»—тоесть измененийнуклеотидов,наблюдаемыхприотсутствииочищающегоотбора.(ПереработаноизG. M. Cooper etal.,GenomeRes.15:901–913,2005.СлюбезногоразрешенияColdSpringHarborLaboratoryPress.)
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 381
вития разных видов. Например, точная связь между линиями человекообразных обезьян и человека не была окончательно установлена, пока в 1980-е гг. не было собрано достаточное количество данных о молекулярных последовательностях, на основании которых было построено дерево, представленное на рис. 4.75. А при сравнении с огромными количеством последовательностей ДНК самых разных млекопитающих, определенных к настоящему времени, удается получить намного более точные оценки наших с ними связей (рис. 4.77).
4.5.4. Сравнение хромосом человека и мыши показывает, каким образом расходятся структуры геномов
Как можно было ожидать, геномы человека и шимпанзе намного более похожи, чем геномы мыши и человека. Хотя размер геномов человека и мыши примерно одинаков и они содержат почти идентичные наборы генов, прошел более длительный период времени, за который могли накопиться изменения, — приблизительно 80 миллионов лет против 6 миллионов лет. Вдобавок к этому, как показано на рис. 4.77, линии родословной грызунов (представленные крысой и мышью) имеют необычайно быстрые молекулярные часы. Следовательно, эти генеалогические линии отошли от линии родословной человека быстрее, чем можно было бы ожидать, руководствуясь иными сведениями.
Как видно из сравнения последовательностей ДНК на рис. 4.78, мутация привела к значительному расхождению последовательностей между человеком
имышью во всех участках, которые не подпадают под юрисдикцию отбора, таких как большинство последовательностей нуклеотидов в интронах. Напротив, в сравнениях человек – шимпанзе почти все позиции последовательностей одинаковы попросту потому, что со времени жизни последнего общего предка прошло не так много времени для того, чтобы большое число изменений успело произойти.
Вотличие от ситуации с человеком и шимпанзе, локальный порядок генов
иобщая организация хромосомы существенно различаются у человека и мыши. Согласно приближенным оценкам, в линиях человека и мыши произошло общим числом около 180 событий разрыва и воссоединения, с тех пор как эти два вида последний раз имели общего предка. В результате этого процесса, хотя у этих двух видов различия в числе хромосом остались небольшими (23 в гаплоидном геноме человека и 20 — у мыши), их общие структуры сильно отличаются. Тем не менее даже после интенсивной перетасовки генома остается много крупных блоков ДНК,
вкоторых порядок генов одинаков у человека и у мыши. Такие отрезки сохранившегося порядка генов в хромосомах упоминаются как области синтении.
Рис. 4.78. Сравнение соответствующих участков гена лептина мыши и человека. Позиции, в которых последовательности отличаются заменой одного нуклеотида, помещены в зеленые прямоугольники, апозиции,которыеотличаютсядобавлениемилиудалениемнуклеотидов,окруженыжелтымполем. Обратите внимание, что кодирующая последовательность экзона намного более консервативна, чем смежнаяснеюпоследовательностьинтрона.
382 Часть 2. Основные генетические механизмы
Неожиданный вывод из подробного сравнения полных последовательностей геномов мыши и человека, подтвержденный результатами последующих сравнений между геномами других позвоночных животных, состоит в том, что маленькие блоки последовательностей удаляются из геномов и добавляются в них удивительно быстрыми темпами. Так, если мы допускаем, что наш общий предок имел геном размером с геном человека (около 3 миллиардов пар нуклеотидов), то мышь должна была потерять в общей сумме приблизительно 45 процентов того генома
врезультате накопленных удалений за последние 80 миллионов лет, тогда как человек потерял около 25 процентов. Однако существенный вклад, который внесли приобретенные последовательности – за счет многих малых дупликаций хромосом и умножения транспозонов, – компенсировали эти удаления. В результате размер нашего генома не изменился относительно размера генома последнего общего предка человека и мыши, тогда как геном мыши уменьшился всего на 0,3 миллиарда нуклеотидов.
Хорошие данные о потере последовательностей ДНК маленькими блоками
входе эволюции можно получить по итогам подробного сравнения большинства областей синтении в геномах мыши и человека. Сравнительное сжатие генома мыши может быть ясно прослежено по результатам таких сравнений, с общей потерей рассеянных по длинным отрезкам ДНК последовательностей, которые в ином случае являются гомологичными (рис. 4.79).
ДНК добавляется к геномам как путем спонтанной дупликации сегментов хромосом, которые содержат десятки тысяч пар нуклеотидов (что будет описано вскоре), так и посредством активной транспозиции (большинство событий транспозиции имеет характер дупликации, потому что исходная копия транспозона остается там, где она была, когда копия встраивается в новый участок; например, см. рис. 5.74). Поэтому сравнение последовательностей ДНК, происходящих от транспозонов, у человека и мыши легко показывает некоторые добавленные
вгеном последовательности (рис. 4.80).
По неизвестным причинам все млекопитающие имеют геномы размером около 3 миллиардов пар нуклеотидов, которые содержат почти идентичные наборы генов, даже при том что только порядка 150 миллионов пар нуклеотидов, кажется, находятся под специфичными для последовательности функциональными ограничениями.
Рис. 4.79. Сравнение синтенической части геномов мыши и человека. Около 90 процентов этих двух геномов может быть выровнено таким способом. Обратите внимание, что, несмотря на идентичный порядок сопоставляемых индексных последовательностей (красные метки), в линии родословной мыши есть общие потери ДНК, которые рассеяны по всей области. Такого типа общие потери типичны для всех таких областей, и ими же объясняется тот факт, что геном мыши содержит на 14 процентов меньшеДНК,чемгеномчеловека.(ПереработаноизMouseSequencingConsortium,Nature420: 520–573,
2002.СлюбезногоразрешенияMacmillanPublishersLtd.)
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 383
Рис.4.80.Сравнениегруппыгеновβ-глобинавгеномахчеловекаимышисотмеченнымместополо-
жением мобильных генетических элементов. Этот отрезок генома человека содержит пять функцио- нальныхгенов,подобныхгенамβ-глобина(оранжевый);сопоставимаяобластьизгеномамышиимеет толькочетыре.ПозициипоследовательностейAluчеловекаобозначенызеленымикружками,апоследовательностей L1 человека — красными кружками. Геном мыши содержит отличающиеся, но схожие мобильныегенетическиеэлементы:позицииэлементовB1(которыеродственныпоследовательностями Aluчеловека)обозначенысинимитреугольниками,апозицииэлементовL1мыши(которыеродственны последовательностямL1человека)обозначеныоранжевымитреугольниками.Отсутствиеподвижных генетических элементов в структурных генах глобина может быть отнесено на счет очищающего отбора, который устранял всякую вставку, которая ставила бы под угрозу функцию гена. (Схему любезно предоставилиRossHardinsonиWebbMiller.)
4.5.5. Размер генома позвоночного отражает относительные скорости приобретения и потери ДНК в последовательности поколений
Теперь, когда мы знаем полную последовательность ряда геномов позвоночных, мы видим, что размер генома может изменяться в широких пределах, очевидно, без резкого эффекта на организм или число его генов. Таким образом, тогда как геномы мыши и собаки попадают в типичные для млекопитающих размерные рамки, курица имеет геном, который составляет лишь около трети генома человека (один миллиард пар нуклеотидов). В особенности примечательный пример организма с геномом аномального размера — северная рыба-собака Fugu rubripes (рис. 4.81), которая имеет крошечный для позвоночного геном (0,4 миллиарда пар нуклеотидов в сравнении с 1 миллиардом и более у многих других рыб). Небольшой размер генома Fugu rubripes обусловлен главным образом небольшим размером его интронов. А именно: интроны, равно как и другие некодирующие сегменты генома Fugu rubripes, не содержат ДНК-повторов, которые составляют большую долю геномов наиболее хорошо изученных позвоночных животных. Тем не менее позиции интронов Fugu rubripes почти в совершенстве сохранились неиз-
менными относительно соответствующих позиций в геномах млекопитающих (рис. 4.82).
Хотя вначале это и было необъяснимой загадкой, теперь мы имеем простое объяснение столь
Рис.4.81.Севернаярыба-собакаFugu rubripes. (Снимоклюбез-
нопредоставилByrappaVenkatesh.)
384 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 4.82. Сравнение геномных последовательностей генов человека и Fugu rubripes, кодирующих белок хантингтин. Оба гена (обозначены красным) содержат по 67 коротких экзонов, которые выравниваются друг с другом в соответствии 1:1; эти экзоны соединены изогнутыми линиями. Ген человека в 7,5 раз крупнее, чем ген Fugu rubripes (180 000 против 27 000 пар нуклеотидов). Разница в размерах обусловленавсецелоболеекрупнымиинтронамивгенечеловека.Большийразмеринтроновчеловека связан отчасти с присутствием ретротранспозонов, позиции которых отмечены зелеными вертикальнымилиниями;винтронахFugurubripesретротранспозоновнет.Учеловекамутациягенахантингтина вызываетболезньХантингтона—наследственноерасстройство,связанноеспоражениемклетокмозга. (ПереработаноизS. Baxendaleetal.,Nat.Genet.10:67–76,1995.Слюбезногоразрешенияиздательства
MacmillanPublishersLtd.)
сильных различий в размере геномов между взаимно подобными организмами: поскольку все позвоночные испытывают непрерывный процесс потери ДНК и приобретения ДНК, размер генома попросту зависит от равновесия между этими противоположными процессами, действующими на протяжении миллионов лет. Предположим, например, что в генеалогической линии, ведущей к Fugu, скорость приобретения ДНК сильно замедлилась. За длительные периоды времени это могло привести к общему «вычищению» из генома этой рыбы тех последовательностей ДНК, потерю которых можно было допустить. В прошлом процесс очищающего отбора в линии родословной Fugu rubripes оставил те последовательности ДНК позвоночных, которые, наиболее вероятно, были функционально активными – всего 400 миллионов пар нуклеотидов ДНК, – очертив тем самым основную область интереса для ученых.
4.5.6. Мы способны реставрировать последовательности некоторых древних геномов
Геномы предковых организмов могут быть выведены абстрактно, но их никогда не удастся наблюдать своими глазами: никаких древних организмов сегодня уже нет. Хотя современный организм типа мечехвоста выглядит поразительно подобным окаменелым предкам, которые жили 200 миллионов лет назад, есть все основания полагать, что геном мечехвоста изменялся в течение всего того времени со скоростью, подобной наблюдаемой в других эволюционных линиях. Ограничения естественного отбора, должно быть, сохраняли ключевые функциональные свойства генома мечехвоста, чтобы отвечать морфологической устойчивости этого
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 385
вида. Однако последовательности геномов показывают, что доля генома, сохраняемая очищающим отбором, невелика; следовательно, геном современного мечехвоста должен сильно отличаться от генома его вымерших предков, известных нам только по окаменелостям.
Есть ли какой-либо путь, позволяющий обойти эту проблему? Можем ли мы когда-либо надеяться расшифровать большие отрезки последовательности генома вымерших предков тех организмов, что живут сегодня? Для организмов, которые состоят в столь же близком родстве, сколь человек и шимпанзе, как мы убедились, это сделать нетрудно. В том случае, если мы хотим разобраться, какое из немногих различий между последовательностями ДНК человека и шимпанзе было унаследовано от нашего общего предка около 6 миллионов лет назад, можно использовать ссылку на последовательность ДНК гориллы (см. рис. 4.76). Чтобы восстановить последовательность ДНК предка, который стал родоначальником большого числа различных организмов, живущих сегодня, нужно сравнить одновременно последовательности ДНК многих видов – так ученые могут реставрировать последовательности ДНК, которые существовали много лет тому назад. Например, по полным последовательностям генома 20-ти современных млекопитающих, которые будут вскоре получены, ученые должны расшифровать бóльшую часть последовательности генома жившего 100 миллионов лет назад млекопитающего бореоэутерии, которое дало начало таким разным видам, как собака, мышь, кролик, броненосец и человек (см. рис. 4.77).3
4.5.7. Сравнение последовательностей ДНК многих видов позволяет выявлять важные последовательности с неизвестной функцией
Огромное количество последовательностей ДНК, имеющееся в современных базах данных (более ста миллиардов пар нуклеотидов), представляет богатые залежи, которые ученые могут «разрабатывать», задаваясь самыми разными целями. Мы уже обсудили, как эта информация может быть использована для восстановления эволюционных путей, которые привели к современным организмам. Но сравнения последовательностей также дают много ответов на вопросы о функционировании клеток и организмов. Возможно, самым замечательным открытием в этой области стало следующее: хотя лишь около 1,5 % генома человека кодирует белки, приблизительно в три раза большее количество (в общей сложности 5 % генома — см. таблицу 4.1, стр. 317) оказалось высококонсервативным в ходе эволюции млекопитающих. Эта масса консервативной последовательности наиболее ясно проявляется, когда мы выравниваем и сравниваем синтенные блоки ДНК многих различных видов. Таким способом могут быть легко идентифицированы так называемые многовидовые консервативные последовательности (multispecies conserved sequences) (рис. 4.83). В большинстве своем некодирующие консервативные последовательности, обнаруженные этим способом, оказались относительно короткими, содержащими от 50 до 200 пар нуклеотидов. Строгая консервативность подразумевает, что они имеют важные функции, которые сохранялись очищающим отбором. Остается разгадать тайну этих функций. Часть консервативной последовательности, которая не кодирует белки, кодирует нетранслируемые молекулы РНК, которые, как известно, имеют важные функции, в чем мы убедимся в последующих главах. Другая доля некодирующей консервативной
3 Интересно, что в настоящее время удалось частично прочитать несколько геномов ископаемых организмов — неандертальца, мамонта, пещерного медведя. — Прим. ред.
386 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.4.83.Обнаружениемноговидовыхконсервативныхпоследовательностей.Вданномпримерепо-
следовательностигеномоввсехпредставленныхорганизмовсравнивали,блокамипо25нуклеотидов, собозначеннойобластьюгенаGFTRчеловека.Доляидентичностипосинтеннымпоследовательностям длякаждогоорганизмаотмеченазеленым.Вдобавоккэтому,дляобнаружениявпределахэтойобласти наиболеевысококонсервативныхпоследовательностейсредипоследовательностейвсехрассматриваемыхорганизмов,былпримененвычислительныйалгоритм.Помимоэкзона,показанытридругихблока многовидовыхконсервативныхпоследовательностей.Функциибольшинстватакихпоследовательностей вгеномечеловеканеизвестны.(ИллюстрациюлюбезнопредоставилEricD. Green.)
ДНК явно участвует в регулировании транскрипции смежных с нею генов, как будет показано в главе 7. Но мы еще не знаем, сколько консервативной ДНК может быть объяснено подобным образом, и львиная ее доля все еще лежит под покровом тайны. Разгадка этой тайны должна иметь глубокие последствия для медицины, и это показывает, как много нам еще предстоит узнать о биологии позвоночных.
Как молекулярным биологам взяться за такую проблему? Первый шаг — провести различие между консервативными областями, которые кодируют белок, и теми, которые его не кодируют, и затем, в числе последних — сосредоточиться на тех, которые еще не имеют какой-либо установленной функции, например, такой как кодирование молекул структурной РНК. Следующая задача состоит в том, чтобы обнаружить, молекулы каких белков или РНК связываются с этими таинственными последовательностями ДНК, как они упаковываются в хроматин и служат ли они
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 387
когда-либо матрицами для синтеза РНК. В основном эта задача все еще находится за пределами наших возможностей, но главное —начало положено и сделаны некоторые замечательные подвижки. Одно из наиболее захватывающих открытий касается эволюционных изменений, которые сделали нас, людей, не похожими на всех остальных, — изменений, говорим мы, в последовательностях, которые оставались консервативными у наших близких родственников, но претерпели внезапно резкое изменение на эволюционном пути человека.
4.5.8. Ускоренные изменения в ранее консервативных последовательностях могут помочь разгадать основополагающие этапы эволюции человека
Как только в распоряжении ученых появились последовательности геномов сразу и человека, и шимпанзе, они стали искать изменения в последовательности ДНК, которые могли бы объяснить поразительные различия между нами и обезьяньей братией. При 3 миллиардах пар нуклеотидов, которые необходимо сравнить у обоих видов, это могло казаться непосильной задачей. Но работа была намного облегчена за счет ограничения поиска 35 000 точно определенных многовидовых консервативных последовательностей (в целом около 5 миллионов пар нуклеотидов), представляющих части генома, которые с наибольшей вероятностью важны
сточки зрения функций. Хотя эти последовательности высококонсервативны, они не остаются абсолютно неизменными, и, когда вариант от одного вида сравнивается с вариантом от другого, обычно оказывается, что они разошлись в небольшой степени, напрямую соответствующей времени, прошедшему с момента жизни последнего общего предка. Однако в малой доле случаев можно заметить признаки внезапного эволюционного всплеска. Например, было обнаружено, что некоторые последовательности ДНК, которые были высококонсервативны у других видов млекопитающих, изменялись исключительно быстро в течение шести миллионов лет эволюции человека — после того как мы отклонились от шимпанзе. Такие
зоны ускоренного развития у человека (human accelerated region — HAR), как думают, отражают функции, которые были особенно важны для формирования наших полезных отличий.
Водном таком исследовании было идентифицировано приблизительно 50 таких участков, одна четверть из которых обнаружена вблизи генов, связанных с развитием нервной системы. Последовательность, подвергнувшаяся наиболее быстрому изменению (18 изменений между человеком и шимпанзе, по сравнению только
сдвумя изменениями между шимпанзе и курицей), была подвергнута дальнейшему изучению и, как установлено, кодирует молекулу 118-нуклеотидной некодирующей РНК, которая вырабатывается в коре головного мозга человека в решающий момент — во время развития этого органа (рис. 4.84). Хотя функция этой РНК, HAR1F, еще не установлена, это волнительное открытие вдохновляет на дальнейшие исследования, которые, будем надеяться, прольют свет на отличительные особенности мозга человека.
4.5.9. Дупликация генов — важнейший источник генетической новизны в ходе эволюции
Эволюция зависит от создания новых генов, а также от модификации уже существующих. Как это происходит? Когда мы сравниваем организмы, которые сильно